Determinando a eficácia antiviral de drogas experimentais por meio de um ensaio de placa

Resumo

Fonte: Yadavalli, T., et al. Explante de tecido corneano suíno para estudar a eficácia dos antivirais do vírus Herpes Simplex-1. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o método para realizar um ensaio de placa usando um vírus obtido da córnea suína infectada. A córnea suína é usada para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.

Protocolo

1. Quantificação da infecção por vírus

NOTA: Os títulos de vírus das córneas suínas devem ser avaliados todos os dias para analisar o efeito do tratamento medicamentoso.

1. Para quantificar o vírus, semeie células Vero a uma densidade de 5 x^10,5 de células por poço se estiver usando uma placa de 6 poços, como feito neste experimento. Faça isso um dia antes da infecção. Incube as células plaqueadas durante a noite para garantir que sejam confluentes para a quantificação do vírus.
2. Alíquota de 500 μL de meio sem soro em vários tubos de microcentrífuga. Insira o cotonete estéril com ponta de algodão embebido nos tubos cheios de meio sem soro. Os cotonetes precisam ser mergulhados e umedecidos por pelo menos 5 minutos antes do uso.
3. Sem perturbar o meio subjacente, transporte a placa de córnea suína infectada para um gabinete de biossegurança. Usando os cotonetes úmidos, faça 3 rotações no sentido horário e 3 voltas no sentido anti-horário a um diâmetro de 5 mm a partir do centro da córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva.
4. Insira de volta o cotonete no tubo de microcentrífuga cheio de mídia sem soro e gire-o no sentido horário e anti-horário 5 vezes. A ponta de metal do cotonete deve ser cortada curta para que se encaixe inteiramente em um tubo de microcentrífuga e a tampa possa ser fechada.
5. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo a ponta de algodão esfregada em uma máquina de vórtice e vórtice em alta velocidade por 1 min.
6. Realize a quantificação do vírus por meio de um ensaio de placa nessas amostras.
   nota: Esta etapa de quantificação precisa ser realizada nos dias 2, 4 e, opcionalmente, 6 dias após a infecção.

2. Quantificação do vírus por ensaio de placa

NOTA: Para realizar um ensaio de placa, cultive e plaquee as células Vero em uma placa de 6 poços e garanta 90% de confluência das células antes do início do ensaio. Utilizar um balão confluente de 75 cm² destas células. Todas as etapas abaixo precisam ser executadas dentro de um gabinete de biossegurança.

1. Lavar a monocamada confluente de células Vero no balão com 10 ml de tampão fosfato fresco salino (PBS) após aspiração do meio de cultura. Repita a etapa de lavagem mais uma vez com PBS após aspirar o primeiro conjunto de soluções de lavagem.
2. Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% à monocamada celular. Incubar o balão a 37 °C durante 5 min. A olho nu, certificar-se de que as células se separam da superfície interior do balão. Caso contrário, aguarde mais 5 minutos antes de examinar novamente o balão. Quando as células parecerem estar separadas, adicione 9 ml de meio inteiro à monocamada para garantir que as células se desprendem completamente da superfície do frasco.
3. Recolha todas as células do balão juntamente com todo o meio e coloque-as num tubo de centrifugação de 15 ml.
4. Para cada poço das placas de 6 poços que são usadas para o ensaio de placa, use 300 μL do tubo da centrífuga. Complete cada poço da placa de 6 poços com 2 mL de meio inteiro. Deixe as placas na incubadora durante a noite para permitir que cresçam e formem uma monocamada confluente em cada poço.
5. Para realizar um ensaio de placa, é necessário realizar uma diluição seriada de amostras antes da quantificação do vírus.
6. Efectuar uma diluição de 101 vezes do vírus em tubos de microcentrífuga utilizando meios isentos de soro até se atingir uma diluição de ^10-8. Quando em uma diluição ^{de 10-3}, transfira 1 mL da diluição para a monocamada de células plaqueadas após aspirar o meio de crescimento nas células da placa de 6 poços, esta será a etapa de infecção. Incubar a placa infectada a 37 °C durante 2 h.
7. Aspire o meio de infecção existente, lave com PBS duas vezes suavemente para revestir as células e adicione 2 mL de meio carregado de metilcelulose por poço a todos os 6 poços. Incubar durante 72 h ou até que se possa observar a formação de placas. As placas podem ser identificadas pela formação de pequenos espaços entre as células na monocamada celular.
8. Adicione 1 mL de metanol lentamente no canto de cada poço, usando a parede como ponta guia. Incube a placa de 6 poços em temperatura ambiente por 15 min. Aspirar lentamente o conteúdo de cada alvéolo da placa sem perturbar ou agitar a monocamada celular.
9. Adicione 1 mL de solução de trabalho violeta a cada poço da placa de 6 poços, garantindo que todas as células estejam cobertas. Incube a placa de 6 poços no escuro por 30 min. Rejeitar a solução de cristal violeta aspirando-a e secar os poços numa folha de papel absorvente.
10. Contar o número de placas no poço de diluição mais elevada para quantificar o teor total de vírus na solução de partida. Repita o processo duas vezes para confirmar o título viral.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulhas hipodérmicas de 30 G.	Bd	305128
Frasco de vidro de 500 mL.	Thomas Científico	844027
Gabinete de biossegurança com certificação Biossegurança Nível 2 (BSL-2).	Thermofisher Científico	Herasafe 2030i
Cotonetes de Alginato de Cálcio Estéreis Calgiswab 6".	puritano	22029501
Raspador de células - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
tubo de centrífuga
Violeta de cristal	Sigma Aldrich	C6158	Armazene o pó em um local escuro
Meio de Eagle modificado de Dulbecco - DMEM	GIBCO	41966029	Conservar a 4 °C até à utilização
etanol	Sigma Aldrich	E7023
Soro fetal bovino -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Alíquota em tubos de 50 mL e manter congelado até o uso
Células Vero	Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC	CRL-1586
Máquina de vórtice
metanol
Metilcelulose
Tubo de microcentrífuga
Córneas suínas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Pedido especial a pedido
Tampas de bancada de procedimento - conforme necessário.	Thermofisher Científico	S42400
Pipetas sorológicas	Thomas Científico	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Equipamento de pipetagem sorológica.	Thomas Científico	Ezpette Pro
Estereoscópio	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Balões de cultura de tecidos, T175 cm2.	Thomas Científico	T1275
Incubadoras de cultura de tecidos que podem manter 5% de CO2 e temperatura de 37 °C	Thermofisher Científico	Forma 50145523
Placas tratadas com cultura de tecidos (6 poços).	Thomas Científico	T1006
tripsina