1. Cepas e manuseio de HSV
NOTA: HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ- recombinantes não espalhantes com atividade repórter de beta-galactosidase são usados para o ensaio.
- Use o vírus de um único lote e armazene a -80 ° C na proporção de 1: 1 do meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 20% de soro fetal bovino (FBS) e leite desnatado até o uso. Antes do armazenamento do lote viral, determine a concentração do vírus pelo ensaio de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-Gal).
- Determine a viabilidade do vírus e a multiplicidade de infecção (MOI) pela coloração X-Gal para cada ensaio experimental executado usando o ensaio de entrada do vírus repórter, conforme descrito anteriormente (Figura 1).
- Vírus diluído (Opt-MEM) para MOI desejado. Fixe as monocamadas (paraformaldeído; 0,5 ml/poço) antes da coloração. Coloque os controles de viabilidade do vírus em uma placa de microtitulação separada em paralelo com as placas de ensaio polimicrobianas.
2. Manipulação de células HeLa 299
- Crescer a 37 °C, 5% de CO2 em DMEM com 4,5 g/L de glicose, 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), gentamicina (50 μg/ml) e L-glutamina. Células de passagem a 80% confluem com solução de tripsina (ácido etilenodiaminotetracético, EDTA 0,53 M; tripsina 0,05%; 5 ml / frasco).
3. Manuseio de C. albicans
NOTA: C. albicans obtido de uma fonte de laboratório clínico é armazenado a -80 °C em leite desnatado Remmel 2x meio.
- Cultivar caldo congelado em meio Sabouraud Dextrose (37 °C). Após 24 horas, subcultive o C. albicans em meio fungisel (37 ° C; 48 horas) para uso.
- Gerar formas germinativas (GT) (colher colónias representativas; 3 ml de FBS; 3 h; 37 °C; absorvância600 (Abs600), 0,3). Após a incubação, lave GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x; 4.000 x g). Adicionar GT lavado ao HBSS aquecido (37 °C; 0,32 Abs600). As formas GT devem ser 99% das células observadas, conforme determinado pela contagem de hemocitômetros.
- Faça suspensões de estoque em forma de levedura (FA) escolhendo colônias representativas de fungos (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs600). Contar o número de formulários de FA/ml microscopicamente usando um hemocitômetro. As formas de FA devem ser 99% das células observadas, conforme determinado pela contagem de hemocitômetros.
- Produzir massa fúngica de trabalho (250 μl de massa GT ou YF em 25 ml de HBSS; 37 °C; 105 unidade formadora de colónias, (UFC/ml)
4. Manuseio de S. aureus
- Loja S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C; Remmel leite desnatado 2x). Cultura em ágar sangue de ovelha (5%; 37 °C; 24 horas). Escolher colónias representativas e transferir para o meio de sais de manitol no prazo de 2 dias para a produção de stock (37 °C; 18 horas).
- Faça a suspensão de estoque de S. aureus (3 ml HBSS; 1,32 Abs600;108 UFC/ml)
- Fazer a matéria-prima de S. aureus (100 μl da matéria-prima em 25 ml de HBSS; 105 UFC/ml).
5. Suspensões de Candida e S. aureus
- Fazer uma suspensão mista de C. albicans e S. aureus (250 μl de massa YF ou GT e 100 μl de massa de S. aureus em 25 ml de HBSS).
6. Ensaio de biofilme polimicrobiano
- Semeie placas de 96 poços com 200 μl de 2 x 105 células HeLa/ml (nível de confluência de 85%). Placas rochosas (30 - 45 min; 37 ° C) antes da incubação (37 ° C; 5% de CO2 incubadora; 18 horas). Monocamadas de lavagem (1x; Opt-MEM) e, em seguida, semear com HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 gJ- em 100 μl de Opt-MEM; MOI 50 e 10). Incubar as placas (3 horas; 37 °C; 5% CO2). Use apenas uma cepa viral por dia.
- Lave as monocamadas infectadas (1x; solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Mg+2 e Ca+2; 100 μl). Substitua o PBS por HBSS quente, deixando 25 μl em cada poço.
- Adicione suspensões de trabalho YF, GT e/ou S. aureus (100 μl; proporção alvo/célula = 5:1; n = 16) conforme indicado na Tabela 1. Incubar as placas (estática; 30 min; 37 °C; 5% CO2).
- Após a incubação, aspirar uma coluna de cada vez, reabastecendo imediatamente com 300 μl de PBS com Mg+2 e Ca+2. Repita esta etapa duas vezes e adicione tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA; filtro esterilizado; 200 μl de uma diluição de 1:50).
- Triturar rapidamente o lisado de células HeLa e, em seguida, colocar 50 μl em sais de manitol (MS) e/ou meios de fungisel (F) (Figura 2). Espalhar o lisado com uma vareta de vidro dobrada num ângulo de 90°. Incubar as placas (18 h a 37 °C). Conte manualmente o número de colônias por placa. Os controles consistem na adesão de S. aureus e/ou C. albicans às células HeLa não infectadas por HSV.
Tabela 1. Determinação geral do modelo de adesão microbiana em interações polimicrobianas.GT= fenótipo do tubo germinativo de Candida albicans; YF= fenótipo de forma de levedura C. albicans; MSSA= Staphylococcus aureus sensível à meticilina; MS= meio de sais de manitol; F= Meio fungisel.
