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1. Soluções e Mídia
- Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio, solução salina tamponada com fosfato (PBS), caldo Sabouraud dextrose e ágar Sabouraud dextrose conforme Tabela 1.
2. Condições de crescimento do inóculo fúngico
- Armazene todas as cepas de fungos como caldos congelados em glicerol a 35% a -80 °C, até que seja necessário.
- Execute as etapas a seguir antes de cada experimento.
- Para cepas de Candida albicans:
- Descongele um frasco de estoque e transfira 200 μL para 10 mL de caldo de dextrose Sabouraud em um tubo estéril de polipropileno de 50 mL com tampa e cultive durante a noite a 30 ° C com agitação (200 rpm). Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa ligeiramente aberta para melhor aeração da cultura.
- Para cepas de Cryptococcus neoformans:
- Raspe a superfície congelada de um frasco para injetáveis. Colocar as células em placas de ágar-Sabouraud dextrose e incubar durante 48 h a 30 °C. Após o crescimento visível de colônias isoladas, mantenha as placas na geladeira (4 ° C) seladas com filme de parafina por até 15 dias.
- Colete uma colônia isolada de tamanho médio da placa usando um palito de dente estéril ou alça de inoculação estéril e inocule 10 mL de caldo Sabouraud dextrose em um tubo cônico estéril de 50 mL. Incubar durante cerca de 24 h a 30 °C sob agitação (200 rpm).
- Não exceda as 24 h de incubação. Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa ligeiramente aberta para melhor aeração. É sempre bom padronizar o estágio de crescimento das células antes de cada teste, pois esse é um fator importante que afeta a resistência antimicrobiana.
nota: Ambos os fungos foram cultivados a 30 ° C para propagação rápida em nossos experimentos, mas a temperatura pode ser alterada para refletir os objetivos do estudo, por exemplo, tratamento clínico (37 ° C). Mais importante ainda, esse tempo inicial de incubação deve ser estabelecido previamente para cada isolado de fungo e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade.
- Após o crescimento do fungo, colete as células centrifugando os tubos cônicos a 1.200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e adicione 10 mL de PBS.
- Ressuspenda as células e centrifugue novamente a 1.200 x g por 5 min em temperatura ambiente.
- Repita a lavagem e centrifugação do PBS mais duas vezes. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em 5 mL (de acordo com o tamanho do pellet) de meio 2X RPMI-1640.
- Prepare 1 mL de uma diluição de 1:100 ou 1:1.000 em um tubo de microcentrífuga (dependendo da turbidez da suspensão celular).
- Alíquota de 10 μL desta diluição, colocá-la em uma câmara de hemocitômetro e contar o número total de células nos quatro quadrantes de canto ao microscópio. Calcular a concentração pela fórmula: (número total de células/4) x factor de diluição x10,4 (constante de diluição da câmara).
- Considere uma viabilidade de 100% se as contagens de viabilidade e as condições de crescimento tiverem sido sistematicamente correlacionadas para o isolado em estudo.
nota: A padronização e o controle de qualidade das contagens de viabilidade podem ser feitos por back-plating de acordo com o método antifúngico de Concentração Inibitória Mínima (CIM) antifúngica do Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST) para leveduras.
- Se a correlação crescimento/viabilidade não tiver sido estabelecida para o isolado em estudo, medir a viabilidade fúngica contando as células vivas em um hemocitômetro com o auxílio de corantes que colorem seletivamente as células mortas, como floxina B11, azul de tripano ou verde Janus. Use as células fúngicas para este protocolo somente se a viabilidade da população neste momento for de 90% ou mais.
NOTA: Corantes mortos/vivos podem não funcionar bem com o fungo de sua escolha. Por favor, teste-os antes de usar. Por exemplo, o corante azul de tripano não funciona bem com C. neoformans.
- Em seguida, prepare as suspensões celulares em meio 2X RPMI-1640 (2X inóculo ajustado em meio RPMI-1640). Para placas de 96 poços, considere um volume de 5 mL para cada placa.
- Para todas as cepas de C. albicans, prepare uma suspensão de células de estoque de 4 x 103 células / mL. Essa concentração é 2X da concentração final de células em cada poço (2 x 103 células/mL).
- Para cepas de C. neoformans, prepare uma cultura de estoque de células 2 x 104 células / mL. Essa concentração é o dobro da concentração final de células em cada poço (1 x 104 células/mL).
- Para outros fungos, testar com um antifúngico conhecido qual a concentração ideal para o estudo específico em relação ao tempo de incubação. Leve em consideração o metabolismo e o tempo de duplicação do fungo.
3. Peptídeos (Agente Desconhecido)
- Armazene os peptídeos liofilizados a -20 ° C e dissolva-os em água deionizada antes de cada experimento. O tempo máximo de armazenamento, uma vez dissolvido em água, dependerá da natureza de cada peptídeo.
- Preparar alíquotas com o dobro da concentração final mais elevada ensaiada no ensaio (2X). O ideal é preparar um pequeno número de alíquotas com peptídeo suficiente para uso único para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
nota: A escolha da concentração deve ser baseada na literatura e nas propriedades do peptídeo. Recomenda-se iniciar as diluições seriadas com aproximadamente 100 μM do peptídeo e, em seguida, diminuir ou aumentar essa faixa de concentração dependendo dos resultados obtidos.
4. Antifúngicos de referência (controlos positivos)
- Para aqueles diluídos em água: prepare uma solução 2X da concentração mais alta da análise (consulte a Seção 5: Ensaio antifúngico para as etapas de diluição).
- Para cepas de C. albicans, prepare uma solução de 128 μg/mL de fluconazol ou 128 μg/mL de caspofungina. A concentração da placa para ambos será de 64 μg/mL.
- Para cepas de C. neoformans, prepare uma solução de 32 μg/mL de anfotericina B (solução solúvel em água). A concentração da placa será de 16 μg/mL.
NOTA: Normalmente, a anfotericina B é diluída em dimetilsulfóxido (DMSO), uma vez que este antifúngico é pouco solúvel em água. No entanto, existem preparações de anfotericina B solúveis em água disponíveis comercialmente.
- Para antifúngicos diluídos em solvente orgânico: prepare uma solução estoque 100X em DMSO e dilua-a a 10X em água para uso.
nota: Assim, no poço, a concentração final de DMSO não excederá 1%. Um poço onde o fungo crescerá em meios contendo 1% de DMSO como controle é necessário, uma vez que alguns fungos não toleram bem essa concentração do solvente. Lembre-se de que o DMSO é fotossensível, portanto, cubra a placa com papel alumínio ou coloque-a em uma câmara escura durante o período de incubação.
5. Ensaio antifúngico
NOTA: Os ensaios antifúngicos in vitro são realizados com base no teste de suscetibilidade à microdiluição em caldo das diretrizes M27-A3 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) com algumas modificações.
- Prepare uma diluição seriada dupla de cada peptídeo e controle o antifúngico em microplacas de poliestireno de 96 poços até um volume final de 50 μL.
- Usando uma pipeta, adicione 100 μL do antifúngico/peptídeo na concentração 2X da maior concentração final desejada nas colunas 1-3, na linha A.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de água estéril nos outros poços, nas fileiras B a H.
- Remover 50 μL dos alvéolos com maior concentração (fileira A), transferir para o poço seguinte da concentração seguinte (fileira B) e homogeneizar.
- Repita as etapas acima até o poço com a concentração mais baixa e descarte 50 μL desse poço (linha H). Deixe as colunas 11 e 12 (linhas A, B, C) com apenas água para controle em branco ou controle negativo/crescimento.
- Adicionar 50 μL do inóculo ajustado 2X em meio RPMI-1640 a cada poço (colunas 1-3 mais coluna 11 (negativo/controle de crescimento)); a concentração final para C. albicans será de 2 x 103 células/mL, e a concentração final para cepas de C. neoformans será de 104 células/mL.
- Prepare controles em branco (50 μL de água + 50 μL de meio 2X RPMI-1640 sem células) e controle negativo/de crescimento (50 μL de água + 50 μL de inóculo ajustado 2X RPMI-1640 meio sem antifúngico) e carregue na placa do poço conforme descrito acima.
- Repita o procedimento para cada composto a ser testado e o controle antifúngico escolhido (colunas 4-10).
nota: As diluições em série podem ser feitas verticalmente como o experimento abaixo, ou horizontalmente na placa (ou seja, se o número de diluições do composto/extrato dado que precisa ser testado for oito ou mais).
- Se os compostos, medicamentos de referência ou qualquer um de seus componentes forem fotossensíveis, realize o ensaio com luz reduzida, cubra as placas com papel alumínio ou coloque em uma câmara escura durante as incubações.
- Considere as seguintes recomendações opcionais.
- Sele a placa com uma placa de cobertura transparente que permita a troca gasosa, pois isso ajuda a reduzir a evaporação.
- Coloque a placa em uma câmara úmida; isso também ajudará a reduzir a evaporação.
- Incubar as placas a 37 °C durante 24 h ou 48 h para todas as estirpes de C. albicans e durante 48 h com agitação de 200 rpm para C. neoformans. O volume final mais baixo (100 μL) garante que não ocorra transbordamento.
nota: Não foi observada diferença significativa entre as leituras de CIM em 24 h e 48 h para as cepas de C. albicans. No entanto, as leituras a 48 h são mais fáceis de visualizar.
- Observe todos os poços, com o auxílio de um microscópio óptico invertido, antes e depois do período de incubação para verificar alterações na morfologia, bem como verificar se há sinais de contaminação.
nota: As leituras podem ser feitas visualmente e fotografadas no final do experimento. Antes de cada leitura, homogeneizar ligeiramente a placa. As leituras também podem ser realizadas medindo seu OD a 600 nm, se aglomerados de células ou filamentação não forem observados.
- Realize os experimentos pelo menos três vezes em datas separadas.
Tabela 1. Preparação de meios e reagentes.
| Média | preparação |
| 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio – 500 mL | 10,4 g de RPMI-1640 (suplementado com L-glutamina e vermelho de fenol; sem bicarbonato) |
| 330 mM de ácido propanosulfónico 3-(N-morfolino) (MOPS) |
| Ajuste para pH 7,0 com NaOH |
| Esterilizar por filtração (filtro de 0,22 μM) |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | 137 mM NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| Autoclave a 121°C por 15 minutos. |
| Caldo de dextrose Sabouraud | 15 g do pó em 500 mL de água destilada. |
| Ajuste para pH 7,0 com NaOH |
| Autoclave a 121°C por 15 minutos. |
| Sabouraud Dextrose Agar | 32,5 g do pó em 500 mL de água destilada. |
| Ajuste para pH 7,0 com NaOH |
| Autoclave a 121°C por 15 minutos. |