Um ensaio de utilização de ATP para determinar a sobrevivência bacteriana sob tratamento com antibióticos

Resumo

Fonte: Wang, Liang-Chun, et al. Exame Quantitativo da Suscetibilidade a Antibióticos de Agregados de Neisseria gonorrhoeae Usando Ensaios Comerciais de Utilização de ATP e Coloração Viva/Morta. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve o ensaio simples de medição de ATP usando o reagente de brilho de luciferase. Este ensaio é usado para quantificar a sobrevida de Neisseria gonorrhoeae após o tratamento com ceftriaxona.

Protocolo

1. Quantificação de viabilidade de agregações de GC

1. Colete GC usando um aplicador estéril. Retire o GC da placa e ressuspenda o GC em caldo pré-aquecido (GCP, Tabela 1) suplementado com soluções de NaHCO₃ a 4,2% e Kellogg a 1%. Utilizar espectrofotometria no comprimento de onda de 650 nm (um OD 650 de 1 = ~1 x 10⁹ UFC/ml) para determinar a concentração de bactérias em suspensão.
2. Ajuste a concentração de GC para ~ 1 x 10⁸ UFC / mL.
3. Adicione 99 μL de suspensão de GC ajustada em poços de uma placa de 96 poços.
4. Incubar a placa durante 6 h a 37 °C com 5% de CO₂ para permitir que as bactérias se agreguem.
5. Adicione 1 μL de ceftriaxona diluída em série (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg / mL) em cada poço. Deixe alguns poços sem tratamento para servir como controle.
6. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C com 5% de CO₂.
7. Sonicar a suspensão 3 vezes em cada poço por 5 s a 144 W e 20 kHz.
8. Adicione 100 μL de reagente luminoso de utilização de ATP disponível comercialmente em cada poço, pipete para cima e para baixo por 3 vezes e incube por 15 min a 37 ° C com 5% de CO₂.
9. Transfira cuidadosamente 150 μL de mistura de cada poço para um novo poço em uma microplaca preta de 96 poços e evite a introdução de bolhas.
10. Meça a absorvância de cada poço a 560 nm usando o leitor de placas.
11. Calcule a taxa de sobrevivência pela razão entre a leitura obtida após o tratamento seriado com ceftriaxona e a leitura de poços não tratados.

2. Análise microscópica de fluorescência de agregados vivos/mortos de GC

1. Colete GC usando um aplicador estéril. Limpe o GC da placa e suspenda novamente o GC em meio GCP pré-aquecido mais 1% de suplementos Kellogg.
2. Determinar o número de bactérias por espectrofotometria no comprimento de onda de 650 nm e ajustar a concentração de GC para ~1 x 10⁷ UFC/ml.
3. Adicione 198 μL de suspensão GC em câmaras de fundo de lamínula de 8 poços.
4. Incubar a câmara durante 6 h a 37 °C com 5% de CO₂ para permitir a formação de agregação.
5. Adicione 2 μL de ceftriaxona (100 μg/mL ou várias diluições) em cada poço dentro de cada condição de agregação. Incubar pelo tempo desejado a 37 °C com 5% de CO₂.
6. Adicione 0,6 μL de mistura de solução de coloração viva / morta em cada poço e incube por 20 min a 37 ° C com 5% de CO₂.
7. Adquira imagens da série Z usando um microscópio confocal (um microscópio equivalente pode ser usado).
8. Analise as imagens usando o software ImageJ para medir o tamanho dos agregados de GC e a taxa de intensidade de fluorescência FIR de coloração viva para morta em cada agregado.

Tabela 1: Receita de 1 L de meio de crescimento bacteriano GCP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100x suplemento Kellogg's
Ágar	Estados Unidos Biológicos	A0930
Ensaio BacTiter	Promega	G8232
Ceftriaxona	TCI	C2226
Base média Difco GC	Bd	Rolamento 228950
Nitrato férrico, nona-hidratado	Sigma-Aldrich	254223-10G
glicose	Thermo Fisher Científico	BP350-1
Coloração BacLight viva/morta	Invitrogen	L7012
Estirpe MS11 Neisseria gonorrhoeae			gentilmente cedido pelo Dr. Herman Schneider, Instituto de Pesquisa do Exército Walter Reed
Soniador	Kontes		Equivalente a 9110001