Determinando o papel das células semelhantes a neutrófilos na sensibilidade das células do linfoma a um medicamento de teste

Resumo

Fonte: Hirz, T., et al. Isolamento e análise de neutrófilos para determinar seu papel na sensibilidade das células do linfoma a agentes terapêuticos. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um ensaio que investiga o papel das células semelhantes a neutrófilos na proteção das células do linfoma contra a citotoxicidade de agentes quimioterápicos. Uma co-cultura 3D, consistindo de linfoma e células semelhantes a neutrófilos, é estabelecida e exposta à vincristina - uma droga quimioterápica. O contato direto com as células semelhantes aos neutrófilos induz uma regulação positiva de proteínas antiapoptóticas nas células do linfoma, promovendo assim sua sobrevivência na presença de vincristina.

Protocolo

1. Diferenciação de células HL60 ao longo da via granulocítica e sua cocultura com células B de linfoma RL em modelo 3D

1. Diferenciação de células promielocíticas humanas (HL60) em células semelhantes a neutrófilos
   1. Ajuste o número de células HL60 para 3 x 10,⁵ células / ml e, em seguida, adicione 1 μM de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO para induzir sua diferenciação. Semeie cada 3 x 10⁵ células HL60 por poço em uma placa de 48 poços e incube por 48 horas a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. Posteriormente, recolher as células e centrifugar a 300 g durante 5 min à RT. Ressuspender as células com meio RPMI completo para contagem utilizando o contador de viabilidade celular.
   3. Em seguida, diluir a suspensão celular em meio RPMI completo para ajustar o número de células HL60 para 3 x 10⁵ células / ml e induzir novamente sua diferenciação adicionando 1 μM de ácido retinóico (RA) e 1,25% de dimetilsulfóxido (DMSO). Semear cada 3 x 10⁵ células HL60 por poço em uma placa de 48 poços e incubar por mais 48 horas a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Análise da diferenciação HL60 (HL60 diff)
   1. Recolha as células e centrifugue os tubos a 300 g durante 5 min à RT. Ressuspenda o pellet com meio completo do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) para contagem utilizando o contador de viabilidade celular.
   2. Analisar as mudanças na expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Colocar cada 3 x 10⁵ células HL60 indiferenciadas (provenientes da cultura de células) e 3 x 10⁵ célulasHL60 diff em tubos de plástico de 5 ml para análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min em RT.
   3. Ressuspenda os pellets em 50 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) - soro fetal bovino (FBS) (4%). Rotular as células com CD11b anti-humano conjugado com AF700 ou CD38 anti-humano conjugado com APC (5 μl/10⁶ células). Incube as células no escuro por 30 min a 4 ^oC.
   4. Lavar com 500 μl de PBS-FBS (4%) e centrifugar a 300 g durante 5 min em RT. Ressuspender os pellets em 200 μl de PBS-FBS (4%).
   5. Analise no citômetro de fluxo usando a estratégia de gating da Figura 1A e a seguinte configuração óptica: laser de 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP); laser de 633 nm: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Para testar as alterações morfológicas noHL60 diff, imobilize as células em lâminas de vidro para exame microscópico.
      1. Para fazer isso, ressuspenda cada 3 x 10⁴ células HL60 indiferenciadas (da cultura de células) e 3 x 10⁴ HL60diff em meio RPMI completo de 150 μl. Monte as lâminas de vidro, cartões de filtro e câmaras de amostra na centrífuga cytospin, garantindo que a centrífuga esteja equilibrada.
      2. Coloque cada tipo de célula na câmara de amostra e citocentrífuga a 1.500 rpm por 10 min em RT. Remova as lâminas, cartões de filtro e câmaras de amostra da centrífuga. Desmonte com cuidado, para não danificar as células da lâmina. Descarte os cartões de filtro e as câmaras de amostra.
      3. Pinte as células com o kit de coloração Giemsa e mantenha as lâminas por 1 hora para secar. Examine as células ao microscópio com ampliação de 100X.
3. Cultura tridimensional (3D<br /> nota: Certifique-se de que os materiais usados neste experimento estejam frios e que o experimento esteja ocorrendo no gelo.
   1. Ressuspenda cada 5 x 10⁴ células RL, isoladamente ou misturadas comHL60 diff na proporção RL:HL60diff 1:10, com 300 μl de matriz de membrana basal usando 1 ml de ponta de pipeta cortada com uma tesoura estéril para alargar a abertura para cerca de 2 a 3 mm. Evite bolhas durante esta etapa.
   2. Semear cada 300 μl de suspensão/poço celular em placa de 24 poços. Evite bolhas durante esta etapa. Incubar a placa durante 30 min a 37 °C com 5% de CO₂, em seguida, adicionar 1 ml de meio RPMI completo para cada alvéolo e incubar durante 7 dias a 37 °C com 5% de CO₂. Troque o meio a cada dois dias. Adicione 10 nM de vincristina no dia 5.
4. Análise FACS
   1. Após 7 dias de cultura, aspirar o meio e lavar cada poço com 1 ml de PBS gelado duas vezes. Adicionar 3 ml/alvéolo de ácido PBS-etilenodiaminotetracético (EDTA) gelado (5 mM). Retire o gel do fundo do poço raspando com o fundo da ponta da pipeta de 200 μl. Agite o prato suavemente no gelo por 30 min.
   2. Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 ml e agite suavemente os tubos no gelo por mais 30 min. Verifique a aparência de suspensão celular homogênea. (Se não for o caso, agite as células por mais tempo ou adicione mais PBS-EDTA).
   3. Centrifugue os tubos a 300 x g por 10 min em RT. Lave os pellets com PBS e centrifugue a 300 x g por 10 min em RT.
   4. Ressuspender com PBS-FBS (4%) e marcar com anticorpo anti-CD19 humano conjugado a PE-Cy7 e anticorpo anti-CD38 humano conjugado a APC (5 μl/10⁶ células). Incubar no escuro por 30 min a 4 ^oC.
   5. Lavar com 500 μl de PBS-FBS (4%) e, em seguida, centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à RT. Ressuspender as células com Anexina V e PI utilizando o kit comercial.
   6. Analise no citômetro de fluxo usando a estratégia de gating da Figura 2A e a seguinte configuração óptica: laser de 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); laser de 633 nm: APC (660/20 BP). Garanta a compensação de cor.

Resultados

Figura 1. Parâmetros estruturais de células HL60 diferenciadas. (A) Os gráficos de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) representam HL60 e células HL60 diferenciadas (HL60 diff). (B) As células HL60 e HL60diff foram marcadas com anti-CD11b-AF700 ou anti-CD38-APC seguidas de análise por citometria de fluxo. Após a ativação de cada populaç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	Rolamento 21875-034
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Solução salina tamponada com fosfato (PBS contém cálcio e magnésio)	Gibco Invitrogen	14040-091
Vincristina	EG Labo
Matriz de membrana basal BD Matrigel	BD Biociências	354234	Colocar a 4 oC durante a noite antes do dia da experiência
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	Rolamento A7906
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Anexando o kit de coloração V-FLOUS	Roche	Nº 11 988 549 001
Kit RAL 555 Kit de coloração Giemsa modificado	Cosmos Biomédico	CB361550-0000
Citometria de fluxo LSRII	BD Biociências
Citocentrífuga	Thermo Científico
Microscópio Leica DMR-XA	Leica Microsystems
Celômetro Auto T4 Contador de Viabilidade de Células	Nexcelom Biociência