Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Inoculação de camundongos C57BL/6 com células tumorais que expressam T Ag
- Cultive a linha celular de fibrossarcoma transformada em SV40 C57SV (ou uma linha celular aderente a T Ag+ semelhante) no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de D-glicose e L-glutamina (1x) e suplementado com 1 mM de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) em frascos tratados com cultura de tecidos a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 10% de dióxido de carbono (CO2).
- Quando as células se tornarem totalmente confluentes ou ligeiramente superconfluentes, remova e descarte suavemente o meio e enxágue a monocamada com solução salina tamponada com fosfato estéril pré-aquecido (PBS).
NOTA: A expressão máxima de T Ag é alcançada quando as células T Ag+ atingem 100% de confluência.
- Dentro de um gabinete de segurança biológica, adicione ácido tripsina-etilenodiaminotetracético pré-aquecido (tripsina-EDTA) (0,25%) para cobrir a monocamada à temperatura ambiente até que as células sejam desalojadas em manchas. Bata nas laterais do(s) frasco(s) de cultura várias vezes para liberar as células aderentes restantes.
NOTA: Se necessário e para acelerar o processo de tripsinização, transferir o(s) frasco(s) para uma incubadora a 37 °C. As células desalojadas adotarão rapidamente uma forma arredondada sob um microscópio de luz. Esta etapa deve durar aproximadamente 5 min.
- Adicionar 5 ml de meio DMEM e dissociar aglomerados para preparar uma suspensão unicelular, pipetando o conteúdo de cada balão para cima e para baixo.
- Transferir a suspensão celular através de um filtro celular com poros de 70 μm para um tubo.
- Gire o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em 10 mL de PBS estéril e frio.
- Repita as etapas 1.6 e 1.7 duas vezes.
- Conte as células usando um hemocitômetro. Prepare uma suspensão uniforme contendo 4 x 107 células/ml de PBS estéril.
- Injectar 500 μL da suspensão acima referida por via intraperitoneal (i.p.) em cada ratinho C57BL/6 macho ou fêmea adulto (6-12 semanas de idade).
2. Regimes de tratamento
- Regime de tratamento para examinar a contribuição das células nTreg para a imunodominância de TCD8
- Quatro dias antes do condicionamento in vivo de camundongos C57BL / 6 com células C57SV (etapa 1.10), injete cada animal uma vez i.p. com 0,5 mg de um anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD25 livre de azida com baixa endotoxina (clone PC-61.5.3), que esgota as células nTreg, ou com um controle de isotipo IgG1 de rato (por exemplo, clone KLH / G1-2-2, clone HRPN ou clone TNP6A7).
- Regime de tratamento para testar a significância in vivo das interações de proteínas de morte celular programadas (PD-1-PD-L1(2)) na formação da imunodominância de TCD8
NOTA: O envolvimento de PD-1 por PD-L1 frequentemente, mas nem sempre, medeia a co-inibição e / ou exaustão de TCD8 específico para Ag. Portanto, o tratamento com anti-PD-1 pode ser realizado em paralelo com a administração de mAbs anti-PD-L1 e anti-PD-L2 para revelar a interação intercelular exata envolvida em um fenômeno biológico.
3. Preparação de esplenócitos alvo
- Eutanasiar camundongos C57BL/6 ingênuos pareados por sexo (6-12 semanas de idade) que servirão como doadores de esplênócitos por luxação cervical.
- Posicione cada mouse com o abdômen voltado para cima dentro de um gabinete de segurança biológica. Pulverize a pele com etanol a 70% (v/v), EtOH. Usando uma pinça e tesoura estéreis, levante a pele e faça uma pequena incisão na linha média ventral. Em seguida, corte a pele em forma de cruz para expor o peritônio.
- Usando uma pinça, puxe o peritônio em forma de tenda, sem arrebatar nenhum dos órgãos internos. Corte o peritônio aberto para expor a cavidade peritoneal e remova suavemente o baço.
- Coloque o(s) baço(s) dentro de um moedor de lenços Dounce de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril. Aplique pressão manual usando o êmbolo de vidro do moedor até que o tecido esplênico se dissipe em uma suspensão de células homogêneas vermelhas.
NOTA: Dependendo do número de animais receptores por grupo experimental, vários baços de camundongos doadores podem ser necessários para a preparação das células-alvo. Até 3 baços podem ser homogeneizados juntos dentro de um moedor de 15 mL.
- Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 ml. Gire o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em 4 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) por 4 min para eliminar eritrócitos.
NOTA: Esta é uma etapa sensível ao tempo. A superexposição dos esplenócitos ao tampão de lise ACK aumentará sua fragilidade e os tornará suscetíveis à morte celular inespecífica.
- A cada tubo, adicione 8 mL de meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contendo 10% de FBS inativado por calor, L-alanil-L-glutamina, 0.1 mM de aminoácidos não essenciais de meio essencial mínimo (MEM), 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e 1x penicilina/estreptomicina, que doravante será referido como meio RPMI completo (Tabela de Materiais).
- Transfira o conteúdo através de poros de 70 μm de um filtro de células para um novo tubo de 15 mL.
- Gire o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em 12 mL de RPMI completo.
- Divida a suspensão de esplenócitos em 3 porções iguais (4 mL cada) em 3 tubos separados.
4. Revestindo esplenócitos-alvo com peptídeos irrelevantes e cognatos
- Rotule os tubos de acordo com os peptídeos que serão usados para pulsar os esplenócitos alvo. Os esplenócitos controle serão pulsados com um peptídeo irrelevante, e cada população de esplenócitos alvo cognatos será pulsada com um peptídeo sintético correspondente ao epítopo imunodominante derivado de T Ag (local IV) ou um epítopo T Ag subdominante (local I ou local II/III) (Tabela 1).
NOTA: A escolha de peptídeos irrelevantes depende da configuração experimental e da cepa de camundongo usada em cada investigação. Os autores costumam usar gB498-505 (um epítopo de peptídeo imunodominante restrito a H-2Kb do vírus herpes simplex [HSV]-1) e/ou GP33-41 (um epítopo de peptídeo imunodominante restrito a H-2Db do vírus da coriomeningite linfocítica ([LCMV]) em camundongos C57BL/6 (Tabela 1). Esses peptídeos são escolhas ideais porque: (i) são derivados de patógenos não encontrados anteriormente no modelo de camundongo descrito aqui; (ii) semelhante aos peptídeos derivados de T Ag, gB498-505 e GP33-41 são restritos e se ligam a moléculas H-2b. Em ensaios de morte in vivo de 'três picos', cada um dos dois picos que correspondem a células-alvo cognatas pode representar esplenócitos pulsados com um peptídeo imunodominante ou subdominante. A escolha de cada conjunto peptídico varia de acordo com os objetivos de cada experimento. Veja a Figura 1 e a Figura 2 como exemplos de tal variação. Para o restante deste protocolo, os sítios I e IV derivados de T Ag representarão peptídeos subdominantes e imunodominantes, respectivamente.
- Pulsar o conteúdo de cada tubo marcado com 1 μM do respectivo peptídeo por 1 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Use um filtro de célula separado (com poros de 70 μm) para cada tubo para remover aglomerados e detritos, se necessário.
- Girar o tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células peletizadas em 12 mL de PBS frio estéril e repita a etapa 4.4 mais uma vez.
NOTA: É importante remover o máximo de FBS possível porque o FBS pode se ligar ao éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) na próxima etapa.
5. Marcação de esplenócitos alvo com CFSE
- Ressuspenda os esplenócitos pulsados por peptídeos em 4 mL de PBS estéril.
- Adicione CFSE a 0,025 μM, 0,25 μM e 2 μM nos tubos contendo esplenócitos pulsados por peptídeos, locais I e locais IV irrelevantes, respectivamente.
NOTA: Para obter uma rotulagem uniforme do CFSE, segure cada tubo em um ângulo de 45 ° antes de adicionar o CFSE ao lado ligeiramente acima da suspensão da célula, seguido imediatamente por um vórtice suave. Isso garantirá a aparência de histogramas suaves no final. Variações de lote para lote e dependentes da idade nas intensidades de CFSE não são incomuns. Portanto, pode ser necessário experimentar doses diferenciais de CFSE antes de decidir sobre as concentrações ideais a serem usadas.
cuidado: O CFSE é tóxico em concentrações superiores a 5 μM.
- Coloque os tubos dentro de uma incubadora a 37 °C por 15 min e inverta-os uma vez a cada 5 min.
- Adicione 3 mL de FBS inativado por calor a cada tubo para interromper a reação CFSE. Complete o conteúdo com PBS estéril.
- Girar o tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células peletizadas em 12 mL de PBS estéril e repita a etapa 5.5.
6. Exame da Marcação CFSE Adequada/Igual de Populações de Esplenócitos Alvo
- Ressuspenda as células peletizadas em 3 mL de PBS.
- Vortex os tubos suavemente. Transfira 10 μL, cada, de suspensões de células CFSEbaixas,intermediárias CFSE (int) eCFSE altas para um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência de poliestireno (FACS) de fundo redondo de 5 mL contendo 200 μL DE PBS.
- Interrogue as células usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Desenhe uma porta de linfócitos com base nas propriedades de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) das células antes de adquirir 5000 eventos que caem dentro da porta de linfócitos no canal FL-1.
- Dentro da população CFSE+ 'pai', desenhe portas de histograma adicionais para identificar as subpopulações CFSEbaixa,CFSE int e CFSEalta.
- Confirme números de eventos iguais ou quase iguais dentro dos três portões. Se necessário, ajustar o número de células nos tubos «fonte» (passo 6.1) antes de misturar e injetar esplenócitos alvo em ratinhos virgens e preparados na secção 7.
7. Injeção de células-alvo marcadas com CFSE em receptores ingênuos e preparados para T-Ag
- Suavemente vórtice os tubos de origem. Transfira as três suspensões celulares marcadas com CFSE em proporções iguais para um novo tubo.
- Complete o conteúdo com PBS estéril.
- Gire o tubo a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda as células peletizadas com PBS estéril.
- Conte as células em azul de tripano por um hemocitômetro para garantir a viabilidade celular de pelo menos 95%.
- Ajuste o volume para injetar 1 x 107 células-alvo mistas / 200 μL de PBS por via intravenosa (i.v.), via veia da cauda, em cada receptor C57BL / 6 mouse.
NOTA: Armazene as células no gelo entre as injeções. Misture suavemente as células-alvo antes de cada injeção. Registre o momento exato da injeção para cada camundongo, o que determinará quando o animal precisará ser sacrificado. É importante manter a duração da citotoxicidade in vivo consistente entre todos os animais no mesmo experimento.
8. Aquisição de dados
- Duas ou quatro horas após a injeção de células-alvo marcadas com CFSE, eutanasiar os camundongos receptores por luxação cervical.
NOTA: A duração da citotoxicidade in vivo pode variar dependendo do sistema experimental empregado, da imunogenicidade dos Ags alvo, da abundância prevista de TCD8 específico do antígeno peptídico no baço e da robustez de sua função lítica, entre outros fatores.
- Remova e processe cada baço separadamente, conforme as etapas 3.2 a 3.9.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 3 mL de PBS.
NOTA: Tome cuidado extra para manusear o tecido esplênico e as preparações celulares a 4 ° C ou em gelo antes das análises citofluorimétricas. Isso é para evitar a citotoxicidade contínua ex vivo.
- Transfira aproximadamente 1x107 células de cada baço processado para um tubo FACS limpo.
- Interrogue as células imediatamente usando um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Desenhe uma porta de linfócitos com base nas propriedades FSC e SSC das células.
- Identifique os esplenócitos do receptor de CFSE e as células-alvo transferidas por CFSE+. Desenhe portas adicionais acomodando populações distintas de células-alvo CFSEbaixas, CFSEint e CFSEaltas.
- Adquira um total de 2000 eventosCFSE low no canal FL-1.
9. Análise dos dados
- Calcule a lise específica de cada população de células-alvo cognatas usando a seguinte fórmula:
% de citotoxicidade específica = 
onde x = CFSEint/número de evento alto em camundongo T Ag-primed, y = CFSEbaixo número de eventos em camundongo T Ag-primed, a = CFSEint/high número de eventos em camundongos ingênuos e b = CFSEbaixo número de eventos em camundongos ingênuos.
nota: Nos ensaios de citotoxicidade de «três picos» em que se avalia a lise específica de mais do que uma população-alvo cognata, não é adequado utilizar frequências de células-alvo. Isso ocorre simplesmente porque a frequência de uma população de células-alvo cognatas é influenciada não apenas pela porcentagem dos controles irrelevantes, mas também pela dos outros esplenócitos-alvo cognatos. Portanto, os números de eventos dentro de cada porta devem ser usados na fórmula acima para calcular com precisão a lise de cada população de células-alvo cognatas (célulasCFSE int ou CFSE altas) contra controlesCFSE baixos.
Tabela 1. Peptídeos introduzidos neste protocolo.
| Fonte de antígeno proteico | Epítopo Peptídico | designação | seqüenciar | Restrição de MHC I |
| SV401 Grande T Ag2 | T Ag206-215 | Sítio I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 Grande T Ag | T Ag223-231 | Sítio II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 Grande T Ag | T Ag404-411 | Sítio IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 Grande T Ag | T Ag489-497 | Sítio V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 Glicoproteína B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL | H-2Kb |
| Glicoproteína LCMV4 | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2Db |
| 1Vírus Símio 40 | | | | |
| 2Antígeno de tumor grande | | | | |
| 3Vírus Herpes Simplex tipo 1 | | | |
| 4Vírus da Coriomeningite Linfocítica | | | |
| *usado como um peptídeo irrelevante | | | |
