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Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
Nota: O plasmídeo usado Lifeact-mCherry é um gentil presente do Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris.
1. Células e Transfecção
Nota: Os macrófagos RAW264.7 são cultivados até a subconfluência em meio completo (meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM e FCS 10% (soro fetal de bezerro)) em uma placa de 100 mm. Eles são transfectados com plasmídeos que codificam proteínas marcadas com fluorescência por eletroporação. Rotineiramente, aproximadamente 5 - 6 x 106 células são transfectadas com 20 μg ou 10 μg de plasmídeo para cada transfecção ou co-transfecção, respectivamente. Observe que outros meios de transfecção baseados em eletroporação ou lipofecção podem ser usados como abordagens alternativas.
- Raspar as células com um elevador de células e ressuspendê-las em 10 ml de meio de cultura, pipetando várias vezes para cima e para baixo.
- Centrifugue a suspensão da célula 300 x g, 5 min em RT em rotor de ângulo oscilante.
- Pré-aqueça 10 ml de meio completo suplementado com 10 μg/ml de gentamicina a 37 °C.
- Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de "tampão de lavagem A" do kit de electroporação.
- Centrifugue a suspensão da célula 300 x g, 5 min à temperatura ambiente em rotor de ângulo oscilante.
- Enquanto isso, prepare a mistura de DNA à temperatura ambiente: 120 μl 2x Buffer B, 20 μg de DNA de plasmídeo que codifica a proteína de interesse, q.s.p. 240 μl H2O.
- Após centrifugação, rejeitar todo o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular na mistura de ADN e transferir para cubetas de electroporação de 4 mm.
- Incubar em RT por 3 min.
- Eletroporado a 250 V, 900 μF.
- Ressuspender imediatamente as células no meio completo pré-aquecido (37 °C) suplementado com gentamicina e colocá-las numa placa de 100 mm.
- Incubar as células transfectadas durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
- Na manhã seguinte, substitua o meio completo por 10 ml de meio de microscopia sem soro (RPMI 1640 sem vermelho de fenol, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM).
2. Opsonização de glóbulos vermelhos
Nota: Como modelo de alvo de partículas para macrófagos, são usados glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs). Normalmente, são usados cerca de 7 x 106 SRBCs por prato de fundo de vidro de 35 mm.
- Lave os SRBCs com 100 μl de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato) / 0,1% BSA (albumina de soro bovino) e centrifugue (600 x g, 4 min).
- Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda os SRBCs em 100 μl de 1x PBS / 0,1% BSA e centrifugue (600 x g, 4 min).
- Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda os SRBCs em 1x PBS / 0,1% BSA com IgG de coelho anti-SRBCs em concentração subaglutinante. Utilizar 500 μl de solução contendo anticorpo/5 μl de SRBCs.
nota: A concentração subaglutinante de anticorpos corresponde à menor concentração que não induziu aglutinação detectada como formação de uma rede. Em geral, a concentração subaglutinante é de 8,2 μg/ml.
- Determinar a concentração de IgG anti-SRBCs necessária para opsonizar os SRBCs por meio de um teste de hemaglutinação. Dilua serialmente os anti-SRBCs IgG (estoque a 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 em uma microplaca. Adicione 2 x 106 SRBCs em cada poço. Incubar a placa no escuro à temperatura livre durante várias horas.
- Incube em RT por 30 minutos com rotação lenta.
- Após duas lavagens em 1x PBS/0,1% BSA conforme descrito acima, ressuspenda os SRBCs opsonizados para IgG (IgG-SRBCs) em meio de microscopia sem soro pré-aquecido (2 ml/prato).
3. Revestimento de polilisina de lamínulas
- Enquanto isso, trate pratos com fundo de vidro de 35 mm com 2 ml de poli-L-lisina a 0,01% por 30 min em temperatura ambiente.
- Lave a louça duas vezes com 2 ml de 1x PBS.
4. Fixação não covalente de SRBCs em pratos com fundo de vidro
- Despeje 2 ml de suspensão SRBCs por prato de fundo de vidro de 35 mm.
- Centrifugue com rotor oscilante a 500 x g durante 2 min em pratos com fundo de vidro de 35 mm.
- Remova o sobrenadante e lave uma vez com 2 ml de 1x PBS / 10% BSA.
- Incube as partículas por 30 min com 2 ml de 1x PBS/10% BSA por prato.
- Lave a louça três vezes com 2 ml de 1x PBS.
- Substitua 1x PBS por 2 ml de meio de microscopia sem soro pré-aquecido (37 °C).
5. Fagocitose visualizada por TIRFM
- Microscópio
nota: A TIRFM foi realizada usando um microscópio equipado com uma objetiva de imersão em óleo (N 100X, NA1.49), uma câmara de aquecimento com CO2 e duas câmeras de detecção de fóton único EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) acopladas a uma lente de 1,5X.
- No dia anterior à sessão de microscópio TIRF, ligue a câmara de aquecimento a 37 ºC para permitir um aquecimento homogêneo do estágio do microscópio.
- Determinação de ângulo crítico
nota: O software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagens TIRF.
- Coloque um prato de fundo de vidro de 35 mm contendo SRBC opsonizado com meio de microscopia sem soro sob o microscópio.
- Raspe as células e ressuspenda-as no meio antes de adicioná-las (100 - 500 μl) no prato.
- Use o software "Live Acquisition" para controlar o microscópio e realizar a excitação com um laser de 491 nm e/ou 561 nm para identificar células que expressam proteínas marcadas com fluorescência.
- Identifique uma célula que expresse as proteínas marcadas com fluorescência.
- Coloque-o no meio do campo e adquira 500 imagens em um comprimento de onda de excitação, com diferentes ângulos começando de 0º a 5º, com um incremento de 0,01º (Figura 1A). Os ângulos são alterados automaticamente pelo sistema de microscópio.
- Determine o ângulo crítico permitindo que a luz incidente seja totalmente refletida na interface vidro/meio e gere a onda evanescente. Usando o software ImageJ Color Profiler, abra a sequência de imagens clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo.
- Selecione uma região de interesse (ROI), com a ferramenta retangular, na célula com uma fluorescência uniforme (Figura 1B amarelo 1).
- Plote a intensidade média de fluorescência do "perfil do eixo Z" medida no ROI com a função dos ângulos no eixo x clicando na guia "Imagem", "Stacks" no menu suspenso e "Plotar perfil do eixo Z" (Figura 1B vermelho 2).
Nota: O ângulo crítico é o ângulo que leva à fluorescência máxima antes de uma diminuição acentuada na fluorescência.
- Use qualquer valor de ângulo no eixo x superior ao ângulo crítico durante a sessão de microscopia para obter um sinal TIRF como exemplo 2.00 (Figura 1C).
- Aquisições
- Usando o software Live Acquisition, configure os parâmetros de aquisição com o módulo "Editor de Protocolo" (Figura 2A).
- Criar um protocolo com um "loop" compreendendo a aquisição de "Multi Canais" para adquirir sinal fluorescente de proteínas de interesse na região TIRF. Insira o ângulo TIRF (por exemplo, 2,00), o tempo de exposição (por exemplo, 50 mseg) e a intensidade do laser (por exemplo, 50%) (Figura 2B 1).
- Introduza um "movimento Z" da objetiva 3 μm acima da região TIRF para obter a aquisição de sinal em epifluorescência com a ferramenta "Multi Channels". Insira um ângulo abaixo do ângulo crítico (como exemplo 1.00), o tempo de exposição (50 ms) e a intensidade do laser (50%) (Figura 2B, 2 e 3).
- Em seguida, adicione um "movimento z" da objetiva de 3 μm abaixo, para retornar na região TIRF (Figura 3B 4). Adicione um "instantâneo" da célula em LED de luz brilhante (diodo emissor de luz) (Figura 2B 5).
- Encontre uma célula de interesse com um nível moderado de expressão de proteína marcada com fluorescência que inicie a fagocitose de SRBC estendendo a membrana plasmática ao redor da partícula.
- Coloque-o no meio do campo.
- Comece a transmitir a aquisição de 500 a 1.000 quadros. Na aba "contagem de loops", digite "750 quadros" (Figura 2B 1).
nota: O software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagens TIRF.
- Abra as imagens de sequência no software Image J clicando em "Arquivo", "Abrir" e escolhendo o arquivo.
- Separe os canais clicando na guia "Imagem ", menu suspenso "Hyperstacks" e na função "Stack to hyperstack". Complete a janela exibida: Ordem: xyctz; Canal (c): número de canais (ex: "2" se você tiver dois fluorocromos); Fatias (z): número de fatias no eixo z (ex: "1" se não houver movimento no eixo z); Frames (t): número de imagens dividido pelo número de canais; Modo de exibição: Tons de cinza.
nota: Duas sequências de imagens separadas são geradas, correspondendo aos dois canais diferentes.
