Um ensaio in vitro para avaliar o impacto imunomodulador dos monócitos na proliferação de leucócitos

Resumo

Fonte: Hsu, P., et al. Avaliação das Propriedades Imunomoduladoras de Células-Tronco Mesenquimais Humanas (MSCs). J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para explorar a influência imunomoduladora das células-tronco mesenquimais (MSCs) na proliferação de células T efetoras. O ensaio inclui a co-cultura de MSCs com PBMCs para induzir a população de monócitos a adquirir um fenótipo imunomodulador, levando à secreção de interleucina-10 (IL-10). Após a incubação com células T CD4⁺ ativadas, os monócitos induzidos suprimem efetivamente a proliferação de células T.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Isolamento de gradiente de densidade de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)

1. Adicionar 25 ml de sangue total heparinizado num tubo de 50 ml com uma pipeta de 25 ml.
   1. Dilua as células com 25 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Adicionar 15 ml de gradiente de densidade Ficoll-Paque a um novo tubo de 50 ml e, inclinando o tubo, adicionar muito lenta e cuidadosamente 25 ml da suspensão celular diluída sobre o gradiente de densidade, de modo a que não haja mistura do sangue total com o gradiente de densidade, ou seja, não haja perturbação da interface do gradiente de densidade do sangue.
3. Centrifugar a suspensão do passo 1.2 a 400 × g durante 30 a 40 min num rotor de balcude oscilante com temperatura controlada sem travão a 20 °C.
   nota: Três camadas distintas devem ser aparentes após a centrifugação: a camada superior é plasma; a camada clara inferior é o gradiente de densidade Ficoll-Paque; e uma fina camada celular intermediária sendo os PBMCs.
4. Aspire e descarte a camada superior por sucção com uma pipeta de Pasteur, com cuidado para não perturbar a camada interfásica das células mononucleares (ou seja, linfócitos, monócitos e plaquetas).
5. Recolha cuidadosamente esta camada de células mononucleares com uma pipeta de 10 ml para um novo tubo de centrifugação de 50 ml.
6. Encher o tubo com 20 ml de PBS, misturar bem e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 20 °C. Retirar completamente o sobrenadante após a centrifugação.
7. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de PBS e centrifugar a 200 × g durante 10-15 min a 20 °C. Retirar completamente o sobrenadante após centrifugação.
   nota: Esta etapa remove as plaquetas - que são indesejadas - dentro dos PBMCs; Esta etapa pode ser repetida para garantir a remoção completa das plaquetas.
8. Se nenhuma seleção de populações específicas for desejada, ressuspenda o pellet celular em meio leucocitário completo (10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina em meio RPMI-1640) para cultura após realizar uma contagem de células para suspender 1 ml de meio por 10⁷ PBMCs antes de prosseguir para a próxima etapa.

2. Marcação Magnética de Populações de Leucócitos

1. Centrifugar a suspensão PBMC a 300 × g durante 10 min e aspirar completamente o sobrenadante.
2. Ressuspenda o pellet celular em 80 μl de PBS por 10⁷ células totais.
3. Adicione 20 μl de esferas magnéticas especificadas (ou seja, esferas magnéticas CD14 para isolamento de monócitos, esferas magnéticas CD4 para isolamento de linfócitos T) por 10⁷ células totais.
4. Misture bem e incube por 15 min a 2 a 8 °C na geladeira.
5. Adicione 1-2 ml de PBS por 10⁷ células para lavar e centrifugue a 300 × g por 10 min.
6. Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender até 10⁸ células em 500 μl de PBS.

3. Seleção Magnética de Subpopulações de Leucócitos

Nota: Uma variedade de separadores e colunas de esferas magnéticas estão disponíveis para isolamento de populações específicas de leucócitos por marcador de superfície celular de vários fabricantes. O isolamento pode ser por seleção positiva com base em um ou alguns marcadores positivos ou por seleção negativa após o esgotamento de populações indesejadas. Uma abordagem geral de realização de seleção positiva usando um marcador (ou seja, CD4 para linfócitos T auxiliares ou CD14 para monócitos) é descrita abaixo.

1. Prepare e prepare o separador magnético incluindo a coluna de separação de acordo com as instruções do fabricante.
2. Aplique o tubo contendo a amostra de PBMCs marcados. Forneça dois tubos de centrífuga de 15 ml para coleta das frações celulares marcadas positivamente e não marcadas, seguindo as instruções do fabricante.
3. Conte o número de células e ressuspenda os leucócitos selecionados positivamente (ou seja, linfócitos T CD4⁺ ou células CD14⁺) em meio leucocitário completo, usando 1 ml de meio por 10⁷ células.

4. Coloração de leucócitos com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para avaliação da proliferação

Nota: O CFSE tem sido amplamente utilizado em investigações imunológicas, tanto para estudos in vivo quanto in vitro. Nosso protocolo foi otimizado para estudo in vitro de interações MSC/PBMC (ou outros leucócitos). Embora as etapas gerais envolvidas na realização da marcação in vitro da CFSE sejam semelhantes, pode haver diferenças na dose específica e no momento do protocolo. Isso pode ser devido a vários fatores, ou seja, o tipo específico de célula usada, o número de células usadas - o que provavelmente pode afetar a intensidade do sinal fluorescente CFSE.

1. Diluir a solução-mãe CFSE (10 mM) em PBS até à concentração de trabalho desejada de 10 μM (solução de trabalho CFSE). Prepare 10⁷ células (ou seja, PBMCs ou células T) para rotulagem com a solução de trabalho CFSE.
2. Centrifugar a 300 × g durante 10 min para obter um sedimento celular e aspirar o sobrenadante.
3. Ressuspender suavemente as células em 1 ml de solução de trabalho CFSE pré-aquecida (37 °C) e incubar as células durante 10 min a 37 °C.
4. Para lavar o excesso de CFSE, dilua a suspensão celular com 10x (em volume) de meio RPMI pré-resfriado (4 ° C) contendo 10% de FBS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 x g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Lave o pellet celular desta maneira mais duas vezes.
5. Re-pellet as células por centrifugação e contagem do número de células. Ressuspenda 10⁷ células (PBMCs ou células T) em 1 ml de meio completo de leucócitos pré-aquecidos frescos.

5. Ensaio de Supressão Efetora Leucócitos Imunomoduladores Induzidos por MSC e selecionados por esferas magnéticas em células T CD4 ⁺ efetoras marcadas com CFSE ativadas

1. Semeie MSCs a 250.000 células em 3 ml de meio completo de MSC em placas de 6 poços (densidade de MSC: 25.000 células/cm²) para fixação O/N em uma incubadora de 37 °C, permitindo que as células-tronco atinjam 80% de confluência. Pelo menos 3 placas de 6 poços são necessárias para garantir PBMCs cocultivadas com MSC suficientes para seleção de subpopulação.
2. Aspire o meio e adicione PBMCs separados de acordo com a Etapa 1, mas em placas de 6 poços a 2,5 x 10⁶ células / poço (densidade celular: 250.000 leucócitos / cm²) com 3 ml de meio completo de leucócitos. Co-cultura por 48-72 horas em uma incubadora a 37 °C.
3. População específica de seleção de esferas magnéticas de leucócitos imunomoduladores induzidos por MSC (ou seja, células CD14⁺) de acordo com as Seções 2-3.
   nota: A coloração intracelular de citocinas para análise por citometria de fluxo pode ser realizada neste ponto para avaliar alterações no perfil de expressão de citocinas leucocitárias, ou seja, expressão de interleucina-10-conforme modulada por MSCs.
4. Adicione células T CD4⁺ alogênicas marcadas com CFSE geradas de acordo com as Seções 2-4 em placas de 24 poços em 1 ml de meio completo de leucócitos (densidade de células T: 250.000 células/cm²) a leucócitos induzidos por MSC selecionados em várias proporções, ou seja, proporções de 1:10, 1:5, 1:2 e 1:1 (célula a célula).
5. Para estimular as células T CD4⁺, adicione microesferas conjugadas α-CD3/28 para obter uma proporção de grânulo-célula de 1:1.
6. Para um controle negativo, coloque 500.000 células T CD4 ⁺ / poço em uma placa de 24 poços (densidade de células T: 250.000 células / cm²) apenas com 1 ml de meio leucocitário completo; para controle positivo, além de plaquear o mesmo número de células T CD4 ⁺ / poço, adicione microesferas conjugadas α-CD3 / 28 para obter uma proporção de grânulo para célula de 1: 1.
7. No^3º dia de co-cultura, avalie a proliferação de células T CD4⁺ marcadas com CFSE (colocadas em tubos de fundo redondo) por análise citométrica de fluxo com excitação de 488 nm e filtros de emissão apropriados para fluoresceína.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ficoll-Paque PLUS	GE Saúde	71-7167-00 AG	Densidade grandiente para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
Kit de Traçador de Células CFDA-SE Vibrante (CFSE)	Tecnologias da Vida	V12883	Etiqueta celular para detecção de divisão celular
Dynabeads Ativador T Humano CD3/28	Tecnologias da Vida	111.32D	Ativação de linfócitos T humanos, por exemplo, células T CD4+, células T CD8+, etc.
Separador autoMACS™	Miltenyi Biotec	Separador autoMACS™	Separador de célula de base magnética
Colunas autoMACS®	Miltenyi Biotec	130-021-101	colunas de separação
Microesferas CD14 humanas	Miltenyi Biotec	130-050-201	Para seleção positiva de monócitos e macrófagos humanos CD14+ de PBMCs
Microesferas CD4 humanas	Miltenyi Biotec	130-045-101	Para seleção positiva de linfócitos T humanos CD4+ de PBMCs
RPMI 1640 Médio	Tecnologias da Vida	Rolamento 11875	PBMC humano/meio de cultura de leucócitos
DMEM, Baixa glicose, piruvato	Tecnologias da Vida	Rolamento 11885	Meio de cultura de células-tronco mesenquimais humanas (MSC)
L-glutamina	Tecnologias da Vida	Rolamento 25030-081	Suplementação para MSC meio completo
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias da Vida	15070-063	Suplementação para PBMC/leucócitos e MSC meio completo
Soro fetal bovino (FBS)	1) Hyclone, para cultura de MSC, 2) Life Technologies, para todas as outras células (ou seja, PBMCs, populações específicas de leucócitos)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Lotes de pré-teste para suporte de cultura in vitro de CTM
Placa de cultura de células de 24 poços	Corning	COR3524	Placa de co-cultura
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430291	PBMCs de isolamento de sangue total por Ficoll-Paque PLUS
Tubo de centrífuga de 15 mL	Corning	430766	Coleta das frações celulares marcadas e não marcadas
Tubos de fundo redondo	Falcão BD	352008	Coleta de células para análise por citometria de fluxo