Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

Resumo

Fonte: Munir, H. et al., Analisando os efeitos das células estromais no recrutamento de leucócitos do fluxo. J. Vis. Exp.(2015)

O vídeo demonstra um método para investigar o impacto das células estromais no recrutamento de leucócitos. Em um modelo de câmara de fluxo de placas paralelas, citocinas pró-inflamatórias induzem a expressão de receptores de adesão pelas células endoteliais, facilitando o recrutamento e a migração de neutrófilos. A conversa cruzada entre células estromais e células endoteliais diminui o recrutamento de neutrófilos para as células endoteliais.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Isolamento e Cultura de Células Endoteliais Humanas Primárias e Células-Tronco Mesenquimais

1. Isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC):
   1. Coloque o cordão umbilical em uma bandeja com papel toalha e borrife com etanol a 70%. Coloque em uma capa de cultura de tecidos. Identifique a veia e canule em ambas as extremidades. Coloque uma braçadeira ao redor da extremidade canulada para prendê-la.
   2. Lave o sangue venoso com solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando uma seringa. Encha a seringa com ar e passe pela veia para remover e descartar o PBS residual.
   3. Descongelar 10 mg/ml de colagenase tipo Ia e diluir 1:10 em PBS (com cloreto de cálcio e magnésio) até uma concentração final de 1 mg/ml. Passar a solução de colagenase para a veia até que ambas as cânulas estejam cheias. Feche os grampos nas cânulas em ambas as extremidades.
   4. Cubra a bandeja com lenço de papel e borrife com etanol a 70%. Coloque o cabo em uma incubadora por 20 min a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO₂).
   5. Retire o cabo da incubadora e aperte as braçadeiras. Massageie o cordão suavemente por 1 min. Lave a suspensão celular com 10 ml de PBS e recolha num tubo de centrifugação de 50 ml.
   6. Encher a seringa com ar e passar através da veia para remover o PBS residual duas vezes, recolhendo o PBS num tubo de centrifugação de 50 ml utilizado no passo 1.1.5. Centrifugue a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT).
   7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio completo de células endoteliais (CE). O meio EC consiste em M199 suplementado com 35 μg / ml de sulfato de gentamicina, 10 ng / ml de fator de crescimento epidérmico humano, 1 μg / ml de hidrocortisona, 2,5 μg / ml de anfotericina B e 20% de soro fetal de bezerro.
   8. Adicionar 4 ml de meio CE e a suspensão CE a um balão de 25 cm². Troque o meio no dia seguinte e depois a cada 2 dias.
   9. CEs exibem uma morfologia semelhante a paralelepípedos (Figura 1Ai). Para ensaios de adesão, os CEs são geralmente semeados quando atingem 100% de confluência (ver Seção 1.4).
2. Isolamento de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais humanos:
   1. Isole o MSC derivado da geléia de Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais frescos ou de cordões que já foram usados para isolar EC. Corte o cordão umbilical em pedaços de 5 cm de comprimento. Corte cada pedaço longitudinalmente para revelar os vasos sanguíneos (2 artérias [brancas, rígidas] e 1 veia [amarela, distendida]).
   2. Usando tesouras e pinças estéreis, remova os vasos sanguíneos e descarte. Corte todo o tecido em 2 - 3 mm³ pedaços. Usando uma pinça, coloque² - 3 mm 3 peças em um tubo de centrífuga de 50 ml.
   3. Descongele 100 mg / ml de colagenase padrão tipo II e dilua 1:100 em 10 ml de PBS até uma concentração final de 1 mg / ml. Descongele 20.000 U / ml de hialuronidase estoque e dilua 1:400 até uma concentração final de 50 U / ml na solução de colagenase.
   4. Adicione um coquetel enzimático ao tubo de centrífuga contendo os fragmentos de tecido. Incubar os fragmentos de tecido durante 5 horas a 37 °C num rotador lento.
   5. Diluir a suspensão celular 1:5 em PBS. Colocar um filtro de poros de 100 μm num novo tubo de centrifugação de 50 ml. Despeje a suspensão de células no filtro de poros de 100 μm.
      nota: Os fragmentos de tecido restantes serão retidos no filtro e as células serão coletadas no tubo de centrífuga de 50ml.
   6. Descarte o filtro. Centrifugue a suspensão celular a 400 x g por 10 min em RT. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet WJMSC em 12 ml de meio de cultura WJMSC completo (meio de Eagle modificado de Dulbecco, DMEM com baixa glicose, 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 100 U / ml de penicilina + 100 μg / ml de mistura de estreptomicina).
   7. Semear todas as células num balão de cultura de^{tecidos de 75 cm 2}. Troque o meio após 24 horas com 12 ml de meio de cultura WJMSC completo. Substitua o meio a cada 2 - 3 dias. As células devem atingir 70 - 80% de confluência dentro de 2 semanas. Passagem quando WJMSC atinge 70 - 80% de confluência (ver Seção 1.4).
3. Expansão das MSC derivadas da medula óssea (BMMSC):
   1. Isole as MSC derivadas da medula óssea humana (BMMSC) conforme descrito anteriormente. Adicionar 10 ml de células estaminais mesenquimais pré-aquecidas, meio de crescimento MSC (MSCGM) num tubo de centrifugação de 15 ml.
   2. Descongele um frasco para injetáveis de p2 BMMSC colocando-o em banho-maria a 37 °C durante 2 min. Adicione a suspensão BMMSC ao tubo de centrifugação que contém MSCGM. Misture bem pipetando.
   3. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a RT. Aspirar completamente o sobrenadante.
   4. Ressuspenda as células em 1 ml de MSCGM e conte as células usando um hemocitômetro ou um contador de células digital, como um celonômetro.
   5. Semeie células em frascos de cultura de 75 cm² a uma densidade de 5.000 - 6.000 células por cm² em 12 ml de MSCGM. Troque o meio após 24 horas com 12 ml de MSCGM. Alimente as células com 12 ml de MSCGM a cada 2 - 3 dias.
   6. Passagem quando o BMMSC atinge 70 - 80% de confluência (ver Seção 1.4). As células exibem uma morfologia fibroblástica (Figura 1Aii).
4. Destacamento de EC e MSC:
   1. Aspirar o meio de 25 cm² balões de cultura. Adicione 2 ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,02% por aproximadamente 2 min. Aspirar EDTA e adicionar 2 ml de tripsina (2,5 mg/ml). Veja ao microscópio até que as células se tornem redondas.
   2. Toque no frasco para separar as células. Inative a tripsina adicionando 8 ml de meio de cultura (dependendo do tipo de célula; Meio EC para HUVEC, DMEM LG para WJMSC e MSCGM para BMMSC) para o frasco de cultura e transferir a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 ml.
   3. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento como a seguir se descrever.
      1. Para a passagem de MSC, ressuspender o pellet num meio de cultura de 3 ml. Adicionar 11 ml de meio de cultura em três balões de cultura separados de^{75 cm 2}. Adicionar 1 ml de suspensão celular a cada balão de cultura (divisão 1:3). Passe WJMSC e BMMSC 3 vezes (p3) antes do uso em ensaios de co-cultura.
      2. Para a semeadura de EC ou MSC em ensaios de adesão – ver Seções 2 e 3.
5. Congelamento MSC:
   1. Na passagem 3, retire o MSC conforme descrito na Seção 1.4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 3 ml de CryoSFM gelado. Pipetar alíquotas de 1 ml de suspensão celular para criotubos gelados de 1,5 ml. Coloque os criogeniais em um recipiente de congelamento.
   2. Armazene o recipiente a -80 °C O/N. Transfira para nitrogênio líquido. Descongele um frasco para injetáveis de MSC (siga os passos 1.3.1 - 1.3.6). Ressuspender o MSC num meio de cultura de 5 ml (escolher o meio adequado para WJMSC ou BMMSC) e semear para um balão de 25 cm².

2. Estabelecendo coculturas de células-tronco endoteliais-mesenquimais em filtros

1. Retire WJ ou BMMSC conforme descrito na Seção 1.4. Ressuspenda o pellet em 1 ml de MSCGM. Realize uma contagem de células usando um hemocitômetro ou um celetômetro.
2. Ajustar o volume de modo a que a concentração final seja de 5 x 10⁵ MSC em 500 μl de MSCGM.
3. Usando uma pinça estéril, inverta os filtros PET Transwell de 6 poços e 0,4 μm e coloque em uma caixa estéril.
4. Semear 5 x 10⁵ MSC na superfície externa dos filtros. Incube os filtros a 37 °C e 5% de CO₂ por 1 hora.
5. Colete a mídia da superfície externa do filtro. Conte o número de MSCs não aderentes na mídia. Inverta novamente os filtros usando uma pinça estéril e coloque-os em uma placa de 6 poços correspondente contendo 3 ml de MSCGM.
6. Adicionar 2 ml de MSCGM na superfície interior do filtro (figura 1B). Colocar numa incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ durante 24 horas. Tripsinizar um balão confluente de 25 cm² de EC (Figura 1Ai; conforme Seção 1.4).
7. Ressuspenda EC em 8 ml de MSCGM (1 frasco de^{25 cm 2} semeará quatro filtros de 6 poços; ~ 5 x 10⁵ EC / filtro). Aspire o meio da parte superior e inferior dos filtros porosos. Adicionar 3 ml de MSCGM fresco na câmara inferior (por baixo do filtro). Adicione 2 ml de suspensão CE à superfície interna de cada filtro. Incubar por 1 hora a 37 °C e 5% de CO₂.
8. Aspire o meio para lavar o EC não aderente e substitua por MSCGM fresco. Configure filtros de monocultura EC paralelos semeando células na superfície interna sem primeiro semear MSC. Incubar O/N a 37 °C e 5% de CO₂.
9. Verifique se a monocamada EC é confluente e não contém lacunas. Monocamadas subconfluentes não podem ser usadas para ensaios de adesão (Figura 1B).
10. Descongele 1 x 10⁵ U / ml de fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e dilua 1:1.000 em MSCGM até uma concentração final de 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Efectuar uma diluição em série diluindo 100 U/ml de TNFα a 1:10 em MSCGM para obter 10 U/ml. Diluir 10 U/ml de TNFα por 1:10 em MSCGM para obter 1 U/ml.
11. Trate as câmaras superior e inferior dos filtros com 1, 10 ou 100 U/ml de TNFα (equivalente a ~10 ng/ml) a 37 °C durante 4 horas antes do ensaio.

3. Isolamento de leucócitos

1. Retire sangue venoso de voluntários saudáveis e alíquota imediatamente em tubos de EDTA. Inverta os tubos suavemente para misturar.
2. Colocar 2,5 ml de Histopaque 1077 em 2,5 ml de Histopaque 1119 num tubo de fundo redondo de 10 ml. Colocar 5 ml de sangue total no gradiente Histopaco. Centrifugue a 800 x g por 40 min em RT.
3. Colher neutrófilos polimorfonucleares periféricos (PMN) na interface do Histopaque 1077 e 1119 (acima da camada eritrocitária). Coloque em um tubo de fundo redondo de 10 ml e faça a maquiagem até 10 ml com PBSA. Inverter suavemente o tubo e centrifugar a 400 x g durante 5 min à RT.
4. Diluir a solução de BSA a 7,5% 1:50 em 100 ml de PBS (com cloreto de cálcio e magnésio) até uma concentração final de 0,15% (p/v; PBSA). Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de PBSA. Centrifugue a 400 x g por 5 min em RT.
5. Ressuspender em 1 ml de PBSA. Tomar uma alíquota de 20 μl da suspensão celular e adicionar a 380 μl de PBSA (diluição 1:20). Conte as células usando um hemocitômetro ou um celômetro. Diluir até à concentração necessária (1 x 10⁶/ml para os filtros Transwell e a microlâmina Ibidi) em PBSA. Manter a suspensão de neutrófilos em RT até ao ensaio.

4. Montagem do sistema de fluxo

1. Configure o sistema de fluxo conforme mostrado na Figura 1C. Ligue o aquecedor e regule para 37 °C. Coloque uma seringa de 20 ml (remova o êmbolo) e uma seringa de 5 ml a uma torneira de 3 vias. Fixe a torneira à câmara de perspex usando fita Micropore.
2. Meça e corte um longo pedaço de tubo de silicone de 2/4 mm (grosso) que é aproximadamente a distância entre a válvula e a torneira de 3 vias. Corte um pedaço de tubo de 8 a 10 mm de comprimento de 1/3 mm (fino) e insira-o em uma extremidade do tubo grosso. Prenda o lado do tubo grosso na torneira de 3 vias.
3. Conecte a extremidade do tubo fino a uma porta da microválvula eletrônica de 3 vias. Este é o "reservatório de lavagem". Corte um pedaço de tubo grosso e fino de 6 a 8 mm de comprimento.
4. Insira o tubo fino em uma extremidade do tubo grosso. Conecte a extremidade grossa do tubo a uma seringa de 2 ml (remova o êmbolo).
5. Conecte a extremidade do tubo fino da seringa de 2 ml a uma porta na microválvula eletrônica para fazer o "reservatório de amostra". Conecte a válvula à câmara de fluxo do filtro medindo e cortando um longo pedaço de tubo fino que é a distância entre a microválvula e o centro do microscópio stage.
6. Para o modelo de microslide, conecte um pedaço de tubo grosso de 8 a 10 mm na extremidade do tubo fino. Coloque um conector em forma de L na extremidade do tubo grosso. Isso se conectará ao microslide. Para o modelo de filtro, conecte um pedaço de 8 a 10 mm do Manômetro Portex Blue Line conectando a tubulação à extremidade da tubulação fina.
7. Coloque a extremidade fina do tubo na microválvula. Esta é a saída comum para os reservatórios de lavagem e amostra. Encha os reservatórios com PBSA. Prepare a tubulação fluindo PBSA através deles para remover quaisquer bolhas de ar.
8. Conecte o tubo do manômetro a uma seringa de vidro de 29 mm (50 ml). Prepare a seringa enchendo-a com 10 ml de PBSA. Inverta a seringa de modo que a extremidade conectada ao tubo fique voltada para cima e empurre todas as bolhas de ar. Reabasteça com 5 ml de PBSA.
9. Apenas para o modelo microslide, conecte um pedaço de tubo de 10 a 12 mm de espessura na extremidade do tubo do manômetro que leva à seringa de vidro. Coloque um conector em forma de L na extremidade do tubo grosso. Coloque a seringa de vidro em uma bomba de seringa para infusão / retirada.
10. Calcule a vazão de recarga (Q) necessária para gerar a tensão de cisalhamento desejada na parede (τ_w em Pascal, Pa) de 0,1 Pa (filtros Transwell) ou 0,05 Pa (microlâminas Ibidi) usando as seguintes fórmulas:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Onde w = largura interna e h = profundidade interna do canal de escoamento. n = viscosidade da solução fluida; PBSA é n = 0,7 mPa.s. Para a câmara de fluxo do filtro de placa paralela, a largura (w) é de 4 mm e a profundidade (h) é de 0,133 mm. A profundidade da câmara pode variar ligeiramente devido a diferenças na espessura da junta Parafilm usada. Para a microlâmina Ibidi, a largura é de 3,8 mm e a profundidade é de 0,4 mm.
    nota: Devido às diferenças nas dimensões do canal de fluxo e na dinâmica de captura, usamos diferentes tensões de cisalhamento para o modelo de microslide em comparação com o modelo de filtro.

5. Configurando a câmara de fluxo de placas paralelas incorporando filtros

1. Corte um pedaço de Parafilm (do mesmo tamanho da lamínula de vidro) usando um gabarito de metal. Corte uma ranhura de 20 x 4 mm no Parafilm (para criar o canal de fluxo) usando um gabarito de metal. Use a junta para marcar o canal de fluxo na lamínula de vidro.
2. Alinhe as bordas do filtro de 6 poços na lamínula de vidro. Certifique-se de que o filtro cubra as marcações do canal de fluxo. Corte cuidadosamente o filtro usando um bisturi tipo 10A.
3. Cubra cuidadosamente o filtro com uma junta Parafilm, certificando-se de que a ranhura do canal de fluxo esteja no meio do filtro (Figura 1D). Use um pedaço de lenço de papel limpo e empurre as bolhas para fora.
4. Coloque a lamínula no recesso da placa inferior da câmara de fluxo de perspex. Posicione a placa superior de perspex sobre a parte superior da junta e aparafuse as placas (Figura 1D).
5. Gire a torneira de 3 vias para permitir que o tampão de lavagem (PBSA) flua através da válvula. Conecte a tubulação do manômetro à porta de entrada da placa superior de perspex. Execute o PBSA através do canal de fluxo para permitir a passagem de bolhas.
6. Conecte a tubulação do manômetro da bomba de seringa à porta de saída da placa Perspex. Defina a bomba da seringa para reabastecer e pressione run. Limpe qualquer PBSA que tenha pingado na placa superior da câmara.
7. Coloque a câmara no palco de um microscópio de contraste de fase invertido. Ajuste o foco para visualizar o EC acima dos filtros (Figura 1B).

6. Perfusão de leucócitos sobre células endoteliais

1. Colocar 2 ml de neutrófilos purificados no reservatório da amostra e deixar aquecer durante 2 min. Lavar o endotélio com PBSA durante 2 min.
2. Ligue a válvula para perfundir neutrófilos sobre o endotélio. Administre o bolus de neutrófilos por 4 min. Desligue a válvula e perfunda PBSA do reservatório de lavagem pelo restante do experimento.
3. Certifique-se de que as bolhas de ar não passem pelo canal de fluxo em nenhum ponto durante o ensaio, pois isso interromperá a monocamada EC e causará o desprendimento dos neutrófilos aderentes.

7. Registro de captura e comportamento de neutrófilos

1. Registre o recrutamento de neutrófilos durante o fluxo de neutrófilos ou pós-perfusão.
2. Faça todas as gravações digitais de pelo menos 5 a 10 campos no centro do canal de fluxo. Identifique o centro do canal movendo a objetiva para a borda do canal na porta de entrada e identificando o meio da porta.
   1. Para gravar durante o fluxo de neutrófilos, tire imagens de um único campo a cada 10 segundos por 1 min. Mova-se ao longo do canal e grave outro campo por 1 minuto. Repita durante o bolo.
   2. Para registrar a pós-perfusão, faça gravações de 10 segundos de 5 a 10 campos no centro do canal de fluxo para avaliar o comportamento dos leucócitos (normalmente 2 minutos após o final do bolo de neutrófilos). Tire fotos a cada segundo dentro do intervalo de 10 segundos. Isso permite tempo suficiente para que a captura do fluxo e o comportamento dos neutrófilos aderentes sejam analisados.
   3. Registre um único campo contendo pelo menos 10 neutrófilos transmigrados por 5 min, tirando imagens a cada 30 segundos. Isso pode ser usado para calcular a velocidade das células migradas (acima ou abaixo do endotélio).
   4. Grave outra série de campos de 10 segundos (normalmente 9 minutos após a perfusão). Isso permite que os neutrófilos tenham tempo para migrar através da monocamada endotelial.
   5. Pare a bomba da seringa e remova a tubulação. Desmonte a câmara de fluxo e enxágue o sample reservatório e tubulação. Repita para filtros/canais de microslides subsequentes.

8. Análise do Recrutamento e Comportamento de Leucócitos

1. Conte o número de neutrófilos em cada campo durante as gravações de 10 segundos no ponto de tempo de 2 minutos. Todas as células devem estar presentes no campo do primeiro e segundo para serem contadas. As células que estão parcialmente no campo em 2 lados (por exemplo, borda superior/direita) do campo de visão são incluídas nas contagens, desde que permaneçam no campo por 10 segundos completos.
2. Calcule o número médio de neutrófilos aderentes por campo. Meça o comprimento e a largura do campo gravado. Calcule a área do campo. Calcule quantos campos existem em 1 mm². Multiplique a contagem média de neutrófilos pelo número de campos em 1 mm².
3. Calcule o número total de neutrófilos perfundidos multiplicando a quantidade de neutrófilos perfundidos (por exemplo, 2 x 10⁶/ml*Q [por exemplo, 0,0999 ml/min para câmara de fluxo de placas paralelas]) pela duração do bolo (por exemplo, 4 min).
4. Divida a contagem de neutrófilos/mm² pelo número total de neutrófilos perfundidos para determinar o número total de células que aderiram (células aderentes/mm²/10⁶ perfundidas).
5. Avalie se os neutrófilos aderentes estão rolando, firmemente aderentes ou transmigrados.
   1. Um neutrófilo rolante é brilhante e se moverá lentamente ao longo da monocamada endotelial (1 - 10 μm / seg).
   2. As células firmemente aderentes são brilhantes e ligadas à superfície do EC, permanecendo estacionárias (ou seja, não se movendo durante a gravação) ou sofreram mudança de forma e estão migrando sobre a superfície do EC (Figura 1Ei).
   3. Um neutrófilo transmigrado é de fase escura e abaixo da camada EC (Figura 1Eii).
6. Calcule a porcentagem de células aderentes que estão rolando, estacionárias e transmigradas. Alternativamente, o comportamento dos neutrófilos pode ser expresso como o número total de células que exibem os diferentes comportamentos, aplicando a mesma fórmula usada para calcular a adesão total (conforme descrito nas etapas 8.6 a 8.7).
   1. Marque a borda dianteira de um neutrófilo rolante. Marque a borda inicial da mesma célula no final da sequência de 10 segundos. Desenhe uma linha entre os 2 pontos e meça a distância que a célula percorreu.
   2. Divida esse valor pela duração da gravação em que a célula está rolando (ou seja, 10 seg). Tente selecionar neutrófilos que estão no campo durante todo o intervalo de 10 segundos.
7. Para calcular a velocidade dos neutrófilos migrando sobre a superfície (forma alterada de fase brilhante) ou abaixo do endotélio (fase escura), use a gravação de 5 minutos.
   1. Desenhe um contorno das células migradas no início da sequência e acompanhe seus movimentos ao longo da sequência. Anote as posições X e Y do centróide a cada intervalo de 1 minuto para cada célula. Subtraia os valores das posições X e Y da primeira imagem da sequência dos valores da segunda imagem. Isso é baseado no teorema de Pitágoras.
   2. Subtraia os valores da segunda imagem da terceira imagem. Faça isso para todas as imagens na sequência. Eleve ao quadrado os valores X e Y e some-os.
   3. Raiz quadrada do valor resultante. Calcule a velocidade de cada célula calculando a média das velocidades calculadas em cada intervalo de minutos. Rastreie 10 neutrófilos migrados e calcule a velocidade média.

Resultados

Figura 1. Estabelecimento de co-cultura de EC-MSC e análise do recrutamento de neutrófilos usando um ensaio de adesão baseado em fluxo. (A) Micrografia de (i) EC primário e (ii) BMMSC de passagem 3 cultivado em frascos de cultura de tecidos. (B) Micrografia de EC e MSC cultivadas em insertos de filtro Transwell de 6 poços. (C) Diagra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo Ia	sigma	C2674	Diluir em 10ml de PBS para obter uma concentração final de 10mg/ml. Conservar a -20°C em alíquotas de 1ml.
PBS de Dulbecco	sigma	D8662	Com cloreto de cálcio e magnésio. Mantenha estéril e armazene em temperatura ambiente.
1X Médio M199	Gibco	Rolamento 31150-022	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar.
Sulfato de gentamicina	sigma	G1397	Conservar a 4°C. Adicionar ao frasco M199 de 500ml.
Fator de crescimento epidérmico humano	sigma	E9644	Armazenar a -20°C em alíquotas de 10μl.
Soro fetal de bezerro (FCS)	sigma	F9665	O FCS deve ser testado em lote para garantir o crescimento e a viabilidade do EC isolado. Inativar o calor a 56 ° C. Armazenar em alíquotas de 10 ml a -20 ° C.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Potente e torna-se tóxico dentro de uma semana, portanto, o meio HUVEC completo e fresco deve ser preparado todas as semanas. Conservar a -20°C em alíquotas de 1ml.
Hidrocortisona	sigma	H0135	O estoque é em etanol. Armazenar a -20°C em alíquotas de 10μl.
Colagenase Tipo II	sigma	C6885	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100mg/ml. Armazenar a -20°C em alíquotas de 100μl.
Hialuronidase	sigma	H3631	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 20.000U/ml. Armazenar a -20°C em alíquotas de 100μl.
Filtro de células de 100μm para tubo de 50ml centifuge	Suprimentos de Laboratório Científico (SLS)	Rolamento 352360	Outros filtros celulares disponíveis comercialmente (por exemplo, Greiner bio-one) também podem ser usados.
DMEM baixo teor de glicose	Biossoros	LM-D1102/500	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar.
Mistura de penicilina/estreptomicina	sigma	Pág. 4333	Conservar a -20°C em alíquotas de 1ml.
Balão de cultura de tecidos de 25cm2	Sls	353109
Frasco de cultura de tecidos de 75cm2	Sls	353136
Frasco para injetáveis de células estaminais mesenquimais da medula óssea	Lonza	PT-2501	Armazene em nitrogênio líquido na chegada. As celas estão na passagem 2 na chegada, mas são designadas como passagem 0. Passe para a passagem 3 e armazene em nitrogênio líquido para uso posterior.
Meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar. Para coloração Cell Tracker Green, use meio sem FCS.
Solução de EDTA (0,02%)	sigma	E8008	Conservar a 4°C. Aquecer em banho-maria a 37°C antes de utilizar.
Solução de tripsina	sigma	T4424	Conservar a -20°C em alíquotas de 2ml. Descongele em temperatura ambiente e use imediatamente.
Criogenias	Greiner bio-one	2019-02	Mantenha no gelo antes de adicionar antes de adicionar a suspensão celular.
Recipiente de congelamento Mr. Frosty	Nalgene	Rolamento 5100-0001	Armazene em temperatura ambiente. Ao adicionar criogeniais, com células armazenadas a -80 ° C por 24 horas antes de transformar as células em nitrogênio líquido.
Corante verde rastreador de células	Tecnologias de vida	C2925	Armazenar em alíquotas de 5μl a -20°C. Diluir em 5ml de MSCGM pré-aquecido (a 37°C).
Câmaras de contagem de células	Nexcelom	SD-100	Como alternativa, um hemocitômetro pode ser usado.
Contador de células T4 automático de celômetro	Nexcelom	Automóvel T4-203-0238
Fator de necrose tumoral α (TNFα)	Sistemas de P&D	210-TA-100	Diluir o estoque em PBS até uma concentração final de 100.000U/ml. Armazenar a -80°C em alíquotas de 10μl.
Filtros PET Transwell de 6 poços e 0,4 μm	Sls	Rolamento 353090
K2-EDTA em tubos de 10ml	Sarstedt		Armazene em temperatura ambiente.
Histopaco 1119	sigma	Rolamento 11191	Conservar a 4°C. Aquecer à temperatura ambiente antes de utilizar.
Histopaco 1077	sigma	Rolamento 10771	Conservar a 4°C. Aquecer à temperatura ambiente antes de utilizar.
Tubo de fundo redondo de 10ml	Bosques de Appleton	SC211 142 COMO
Solução de 7,5% BSA Fração V	Tecnologias de vida	Rolamento 15260-037	Conservar a 4°C.
Seringas de Plastipak de 20ml	Falcão BD	300613
Seringas de Plastipak de 5ml	Falcão BD	302187
Seringas de Plastipak de 2ml	Falcão BD	300185
Fita cirúrgica hipoalergênica 3M 9m x 2,5cm	Micropore	1530-1	Use para prender a torneira da seringa na parede da câmara de perspex.
Tubo de borracha de silicone, diâmetro interno/diâmetro externo (ID/OD) de 1/3mm (tubo fino)	Fisher Científico	FB68854	Corte o tubo de silicone no tamanho apropriado. Todos os tubos que levam diretamente à microválvula eletrônica devem ser finos.
Tubo de borracha de silicone ID / OD de 2 / 4 mm (tubo grosso)	Fisher Científico	FB68855
Tubulação do manômetro Portex Blue Line	Smiths	Diâmetro 200/495/200	Tubulação que leva à bomba de seringa.
Torneira de 3 vias	BOC Ohmeda AB
Seringa de vidro 50ml para bomba	Popper Micromate	550962	Deve ser preparado antes do uso, removendo quaisquer bolhas de ar.
Lamínula de vidro	Raymond Um Cordeiro		lamínulas de 26x76mm feitas sob encomenda. Número do lote 2440980.
Junta de parafilme	Empresa Nacional Americana de Latas		Corte um pedaço de parafilme de 26x76mm usando um gabarito de alumínio e corte uma ranhura de 20x4mm nele usando um bisturi 10a. A espessura da junta é de aproximadamente 133μm.
Duas placas paralelas de perspex	Laboratório de Tecnologia Aplicada Wolfson		Câmara especialmente projetada composta por placas paralelas unidas por 8 parafusos. A placa inferior tem uma ranhura de visualização cortada no meio e um recesso raso fresado para permitir espaço para a lamínula, filtro e gaxeta. A placa superior de perspex possui um orifício de entrada e saída posicionado sobre o canal de fluxo.
Microválvula eletrônica de 3 vias com espaço morto mínimo	Lee Produtos Ltda.	LFYA1226032H	Conectado eletronicamente a uma fonte de alimentação de 12 volts DC.
Bomba de seringa para perfusão/retirada (PHD2000)	Aparelho de Harvard	70-2001	Defina o diâmetro para 29 mm e a taxa de recarga (fluxo).
Conector em L	Cabana de laboratório	LE876	Para conectar às portas de entrada e saída no canal microslide Ibidi.
Câmera de vídeo	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Conectado a um computador que permite gravar vídeos digitais.
Image-Pro Plus 7.0	Cibernética da mídia	41N70000-61592	Para análise de dados. Marque manualmente as células que exibem os diferentes comportamentos. Células de rastreamento para análise de velocidades de rolamento e migração.