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1. Indução de senescência por quimioterápicos em cultura de células cancerígenas
NOTA: Todas as etapas de manipulação de células nesta seção devem ser executadas em um gabinete de biossegurança usando práticas estéreis. Esta seção foi escrita para tipos de células aderentes. As células em suspensão podem ser usadas com as modificações apropriadas, conforme observado.
- Cultive linha(s) de células cancerígenas de acordo com o protocolo padrão do fornecedor ou do laboratório que forneceu a(s) linha(s) celular(is) específica(s) usada(s).
nota: As células de baixa passagem (p < 10) são geralmente preferidas, pois haverá níveis mais baixos de senescência replicativa, ou seja, menor fundo, em amostras de células não tratadas.
- Um dia antes da indução da senescência por drogas, colha as células com tripsina-EDTA 0,25% (ou conforme recomendado). Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura completo e transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril.
nota: Esta etapa não é necessária para células em suspensão.
- Conte as células usando o método padrão do hemacitômetro e registre as células/mL. Células da placa a 1 × 103-10 × 103 células/cm2 em placas de cultura plásticas padrão de 6 poços.
nota: A densidade ideal do plaqueamento depende da taxa de proliferação das células e deve ser determinada pelo usuário. As células devem estar em fase logarítmica de crescimento em aproximadamente 10% -20% de confluência no momento do tratamento (ou seja, após 18-24 h de incubação após o plaqueamento). A densidade inicial (células/ml) das células em suspensão deve ser determinada pelo utilizador. As placas de seis poços normalmente produzem células senescentes suficientes por poço para uma amostra de análise de citometria de fluxo padrão. Se houver classificação por fluxo, uma área de superfície muito maior (por exemplo, várias placas P150) deve ser usada para permitir a recuperação de um número suficiente de células senescentes para ensaios a jusante (≥1 × 106).
- Incubar as células plaqueadas durante a noite (18-24 h) em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 e uma bandeja de umidade.
- Trate as células plaqueadas com drogas quimioterápicas indutoras de senescência. Inclua pelo menos um controle positivo, por exemplo, etoposídeo (ETO) ou bleomicina (BLM). Prepare poços duplicados por medicamento. Inclua um conjunto tratado com somente veículo como controle.
nota: O utilizador deve testar uma curva de dose para cada agente experimental para determinar a concentração ideal para a indução de senescência na(s) linha(s) celular(is) utilizada(s).
- Incubar as células durante 4 dias numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e uma panela de humidade para permitir o início da senescência. Examine diariamente as mudanças morfológicas esperadas usando um microscópio de luz.
nota: Tempos de incubação de 3-5 dias podem ser aceitáveis, dependendo da taxa de início da senescência. O meio pode ser trocado e o agente reaplicado (ou não), conforme desejado, para promover condições saudáveis de crescimento, ao mesmo tempo em que atinge uma porcentagem aceitável de células senescentes.
- Após o início da senescência, colha as células adicionando tripsina-EDTA 0,25% por 5 min a 37 °C. Quando as células estiverem dissociadas em suspensão, neutralize a tripsina com um volume igual de meio completo.
nota: Esta etapa não é necessária para células que crescem em suspensão. Se a coloração do marcador de superfície for realizada, evite o uso de tripsina-EDTA, pois pode destruir temporariamente os antígenos de superfície nas células. Em vez disso, dissocie suavemente a monocamada usando um raspador de células de plástico estéril (ou um reagente de dissociação alternativo projetado para preservar antígenos de superfície).
- Conte as células em cada amostra usando um hemacitômetro. Calcule as células/mL para cada amostra.
nota: O azul de tripano pode ser adicionado para avaliar a porcentagem de células mortas neste ponto (ou seja, devido ao tratamento medicamentoso), mas a morte celular também será determinada com um corante de viabilidade fluorescente durante o fluxo de trabalho de coloração DDAOG.
- Alíquota ≥0,5 × 106 células por amostra em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
nota: O número de células por amostra deve ser padronizado em todas as amostras.
- Centrifugue os tubos por 5 min a 1.000 × g em uma microcentrífuga a 4 °C. Remova o sobrenadante.
nota: Se uma microcentrífuga refrigerada não estiver disponível, pode ser aceitável realizar centrifugações à temperatura ambiente para certos tipos de células resilientes.
- Prossiga para a coloração DDAOG na seção 2.
2. Coloração DDAOG de SA-β-Gal em amostras de células
- Diluir o estoque de bafilomicina A1 1 mM a 1:1.000x em meio DMEM (sem FBS) para uma concentração final de 1 μM.
- Adicionar a solução preparada de Baf-DMEM às amostras de sedimentos celulares (do passo 1.11) para uma concentração de 1 × 106 células/mL.
nota: Por exemplo, se estiver usando 0,5 × 106 células por amostra, adicione 0,5 mL de Baf-DMEM.
- Incubar por 30 min a 37 °C (sem CO2) em um rotador/agitador ajustado em velocidade lenta.
nota: Evite incubadoras de CO2 para o processo de coloração, que podem acidificar as soluções e, assim, interferir na coloração de Baf e DDAOG.
- Sem lavar, adicione a solução-mãe DDAOG (5 mg/ml) a 1:500x (10 μg/ml final) a cada amostra. Pipeta para misturar. Substitua em um rotador/agitador a 37 °C (sem CO2) por 60 min. Proteja da luz direta.
- Centrifugue os tubos por 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
- Lave com 1 mL de BSA a 0,5% gelado por tubo e pipeta para misturar. Centrifugue os tubos por 5 min a 1.000 x g a 4 °C e remova o sobrenadante. Repita esta etapa 2x para lavar bem as células. Remova o sobrenadante e prossiga.
nota: É importante executar as etapas de lavagem na etapa 2.6 para remover o DDAOG não clivado, que pode exibir emissão de fluorescência indesejada (460/610 nm).
- (Opcional) Fixação e armazenamento de células coradas com DDAOG para análise posterior
- Adicione 0,5 mL de paraformaldeído a 4% gelado gota a gota a cada amostra lavada. Pipeta para misturar.
- Incube por 10 min em temperatura ambiente.
- Lave as células 2x com 1 mL de PBS.
- Armazene as amostras por até 1 semana a 4 °C antes da análise por citometria de fluxo.
nota: Para amostras fixas, pule a etapa 2.8.
- Dilua o estoque de Calcein Violet 450 AM (1 mM) a 1:1.000x em 1% BSA-PBS (1 μM final). Adicionar 300 μL (para amostras de células cultivadas) aos grânulos de células lavadas do passo 2.6. Incube por 15 min no gelo no escuro.
- Prossiga para a configuração da citometria de fluxo (seção 3).
3. Configuração do citômetro de fluxo e aquisição de dados
- Transferir as amostras de células para tubos compatíveis com o instrumento de citometria de fluxo. Coloque os tubos no gelo e mantenha-os protegidos da luz.
nota: Se forem observados agregados nas suspensões celulares, passar a suspensão por filtros de células de 70-100 μm antes da análise. Não use filtros de 40 μm porque eles podem excluir algumas das células senescentes maiores.
- No software referenciado (consulte a Tabela de Materiais), abra os seguintes gráficos: 1) gráfico de pontos FSC-A vs SSC-A, 2) histograma de canal violeta, 3) canal vermelho distante (por exemplo, APC-A) versus canal verde (por exemplo, FITC-A) gráfico de pontos.
nota: Gráficos de exclusão de dupletos e histogramas de canal único também podem ser usados, mas não são estritamente necessários.
- Inicie a aquisição de dados do citômetro.
- Coloque a amostra de controle somente do veículo corada com DDAOG na porta de admissão. Em uma velocidade de entrada baixa, comece a adquirir dados de amostra.
- Ajuste as tensões FSC e SSC para que >90% dos eventos estejam contidos no gráfico. Se as células não se encaixarem bem no gráfico, diminua a configuração de escala de área para 0,33-0,5 unidades.
- Remova a amostra somente do veículo sem registrar dados.
- (Opcional) Adicione uma gota de microesferas de calibração de arco-íris a um tubo de citômetro com 1 mL de PBS. Coloque o tubo na porta de entrada do citômetro. Comece a adquirir dados de exemplo.
- Ajuste as tensões dos canais violeta, verde e vermelho distante para que o pico superior da microesfera do arco-íris esteja na faixa de 104-105 unidades de fluorescência relativa em cada canal e todos os picos estejam bem separados em cada canal. Recorde de 10.000 eventos. Remova o tubo.
- Coloque a amostra de controle positivo (por exemplo, BLM, ETO) corada com DDAOG na porta de entrada. Em baixa velocidade, adquira dados de amostra. Observe os eventos nos canais FSC, SSC, violeta, verde e vermelho distante para garantir que mais de 90% dos eventos estejam contidos em todos os gráficos. Procure um aumento no sinal AF e DDAOG em comparação com o controle somente do veículo.
- Se estiver usando um citômetro de classificação, inicie a classificação nesta etapa.
- Para fins de manutenção de registros, registre 10.000 células para a amostra de controle e cada amostra classificada.
- Classifique a quantidade desejada de células (≥1 × 106 é normalmente adequado) em um tubo de coleta apropriado para o instrumento com 3-5 mL de meio de cultura.
- Após a classificação, prossiga para a cultura ou análise a jusante.
nota: Para o citômetro de fluxo calibrado usado aqui, as tensões ideais do canal normalmente caem entre 250 e 600 (faixa intermediária), mas as tensões ideais e as faixas de tensão do canal variam entre os instrumentos. Evite usar voltages em faixas muito baixas ou altas, o que pode suprimir o sinal ou amplificar o ruído.
- Depois de concluir as etapas 3.1-3.5 e fazer ajustes nas configurações do citômetro conforme necessário, registre os dados de todas as amostras. Certifique-se de que as configurações permaneçam uniformes para todas as gravações de amostra. Recorde ≥10.000 eventos por amostra de células cultivadas.
nota: Embora o gating e a análise possam ser realizados usando o software de aquisição de dados (por exemplo, FACSDiva), um fluxo de trabalho completo de gating e análise a ser conduzido após a aquisição usando um software de análise separado (FlowJo) é descrito na seção 4 abaixo. A análise pós-aquisição é preferida para reduzir o tempo na estação de trabalho do citômetro e aproveitar as ferramentas adicionais incluídas no software de análise dedicado.
- Salve dados de amostra no formato de arquivo .fcs. Exporte os arquivos para uma estação de trabalho equipada com software de análise de citometria de fluxo (por exemplo, FlowJo).
4. Análise de dados de citometria de fluxo
NOTA: O fluxo de trabalho apresentado usa o software FlowJo. Um software alternativo de análise de dados de citometria de fluxo pode ser usado se as principais etapas descritas nesta seção forem seguidas de forma semelhante.
- Usando o software FlowJo, abra os arquivos de dados .fcs da etapa 3.7.
- Abra a janela de layout.
- Arraste e solte todas as amostras na janela de layout.
- Células viáveis de porta.
- Primeiro, clique duas vezes nos dados de amostra do controle somente do veículo para abrir sua janela de dados.
- Visualize os dados como um histograma de canal violeta. Identifique as células viáveis coradas pelo CV450 com base em sua fluorescência mais brilhante do que as células mortas.
- Desenhe uma porta usando a ferramenta de histograma de porta única para incluir apenas células viáveis. Nomeie o portão viável.
- Em seguida, na janela de layout de amostra, arraste a porta viável para as outras amostras de célula para aplicar a porta uniformemente.
- Na janela de layout, visualize todas as amostras como histogramas de canal violeta (viabilidade). Verifique se o gating de células viáveis é apropriado entre as amostras antes de prosseguir; caso contrário, faça os ajustes necessários.
nota: A coloração de viabilidade pode apresentar variações entre os tratamentos.
- Células senescentes de portão.
- Clique duas vezes nos dados da célula viável fechada para o controle somente do veículo para abrir sua janela de dados.
- Visualize os dados como um gráfico de pontos para canal vermelho distante (DDAOG) versus canal verde (AF).
- Desenhe uma porta usando a ferramenta de passagem retangular para incluir <5% das células que são DDAOG+ e AF+ (quadrante superior direito). Nomeie o portão senescente.
- Em seguida, na janela de layout de amostra, arraste a porta senescente para os subconjuntos viáveis das outras amostras de célula para aplicar a porta uniformemente.
- Na janela de layout, arraste e solte todos os subconjuntos de células viáveis bloqueados na seção 4.4. Visualize todas as amostras viáveis como gráficos de pontos de canal vermelho distante (por exemplo, APC-A) versus canal verde (por exemplo, FITC-A).
- Certifique-se de que a porta senescente desenhada na etapa 4.5.3 seja visível em todas as parcelas e que a porta para o controle somente do veículo exiba ≤5% a 10% de células senescentes.
- Uma vez que a porcentagem de células senescentes tenha sido determinada usando as etapas acima, apresente os dados resultantes usando os gráficos FlowJo, resumidos em uma tabela de dados e/ou analisados estatisticamente usando um software padrão.