Detecção de contaminação bacteriana usando nanossensores magnetofluorescentes

Resumo

Fonte: Shelby, T., Sulthana, S., McAfee, J., Banerjee, T., Santra, S. Triagem de patógenos transmitidos por alimentos usando nanossensor magnetofluorescente: detecção rápida de E. coli O157:H7. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra uma técnica para detectar contaminantes bacterianos em amostras de alimentos e água usando nanossensores. As bactérias patogênicas alvo são detectadas por meio de uma combinação de relaxamento magnético e modalidades de emissão de fluorescência.

Protocolo

1. Detecção rápida de E. coli O157:H7 usando MFnS

1. Crave várias soluções de PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) com quantidades crescentes do estoque bacteriano ^10-6, resultando em faixas de UFC de 1-100. Adicione uma quantidade consistente de MFnS (100 μL) a essas soluções.
2. Crie uma solução de linha de base que contenha apenas PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) e MFnS (100 μL).
3. Incubar as soluções durante 30 min a 37 °C e depois deixá-las arrefecer até à temperatura ambiente.
4. Transfira soluções individuais para o relaxômetro magnético (0,47 Tesla) e registre as mudanças nos tempos de relaxamento (T2) em relação às UFC em cada solução.
   1. Para registrar alterações nos valores de T2, comece medindo o valor de T2 da solução de linha de base que contém apenas PBS e MFnS.
      1. Coloque a solução no relaxômetro magnético. Abra o respectivo software, selecione a configuração "relaxamento T2" e pressione "medir".
      2. Após a coleta do T2 basal, medir os valores de T2 das soluções adicionais que foram enriquecidas com várias concentrações de bactérias.
         nota: A mudança em T2 é equivalente ao T2 basal subtraído do T2 com pico.
5. Remova as amostras do relaxômetro magnético e centrifugue os tubos a 2880 x g por 10 min.
6. Decantar o sobrenadante e ressuspender os grânulos bacterianos em 100 μL de PBS (1X, pH 7,4).
7. Adicione 80 μL de cada ressuspensão a uma placa de 96 poços e registre as intensidades de fluorescência a 595 nm.
   nota: O teste pode ser repetido usando diferentes solventes, incluindo água do lago, leite e outros, conforme descrito na seção de resultados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto Ferroso Tetrahidratado	Fisher Científico	I90-500
Cloreto férrico hexahidratado	Fisher Científico	I88-500
Hidróxido de amônio	Fisher Científico	A669S-500
ácido clorídrico	Fisher Científico	A144S-500
Ácido poliacílico	Sigma-Aldrich	323667-100G
Edc	Thermofisher Científico	22980
Nhs	Fisher Científico	AC157270250
Anticorpo anti-E. coli O111	Cuidados com sora	Rolamento 5310-0352
Anticorpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6	Abcam	AB75244
Mancha DiI	Fisher Científico	D282
Caldo Nutriente	Difco	Rolamento 233000
Pellet de E. coli O157:H7 liofilizado	ATCC	700728
Relaxomteter magnético	Bruker	MQ20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Leitor de placas	Tecano	Infinito M200 PRO
Coluna Magnética	QuadroMACS	130-090-976
centrifuga	Eppendorf	Série 5804
Centrífuga (accuSpin Micro 17)	Fisher Científico	13-100-676
Incubadora de agitação modelo de piso	LABORATÓRIO DE SHEL	SSI5
Balança Analítica	Metler Toledo	ME104E
Mixer de vórtice digital	Fisher Científico	02-215-370
Agitador de balanço ao ar livre	Fisher Científico	02-217-765