1. Preparação de reagentes
- Meio de sais biliares: Para preparar caldo tríptico de soja (TSB) contendo 0,4% de sais biliares (peso/volume), ressuspenda 200 mg de sais biliares em 50 mL de TSB autoclavado. O filtro esteriliza usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco médio semanalmente.
anotações: Os sais biliares usados rotineiramente são uma mistura 1:1 de colato de sódio e desoxicolato de sódio isolado de vesículas biliares ovina e bovina. Como demonstrado anteriormente, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. O TSB adicionou glicose em relação ao caldo Luria-Bertani (LB); e, portanto, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e nos demais patógenos entéricos analisados. Dependendo das bactérias a serem analisadas, podem ser necessárias diferentes concentrações de glicose ou diferentes necessidades de açúcar.
- 0,5% p/v de cristal violeta em água: Dissolva 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
2. Preparação de Bactérias
- Cultive culturas noturnas das cepas bacterianas a serem testadas inoculando 3 mL de TSB com uma única colônia bem isolada em um tubo de cultura estéril. Incubar a 37 °C com agitação a 225 rpm para incubação durante a noite (16 - 24 h).
nota: As cepas devem ser retiradas novamente dos estoques do freezer a cada 2 a 4 semanas e mantidas em placas com no máximo 2 semanas de idade.
3. Ensaio de Aderência em Fase Sólida
NOTA: Este ensaio quantifica as bactérias aderentes usando um método de placa de 96 poços. As bactérias são cultivadas estaticamente em placas de fundo plano. A lavagem é realizada para remover bactérias não aderentes e as bactérias aderentes são coradas com cristal violeta. A coloração violeta cristalina se liga ao peptidoglicano na parede celular bacteriana e pode ser solubilizada usando etanol. O número de bactérias aderentes é determinado com base na retenção de cristal violeta.
- Configure dois tubos de 1,5 mL. Rótulo com TSB ou TSB + sais biliares (BS).
- Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS aos respectivos tubos.
- Inocular os tubos com 20 μL de cultura durante a noite (numa diluição de 1:50).
- Em uma placa estéril, transparente, de fundo plano e tratada com cultura de tecidos de 96 poços, adicione 130 μL/poço de meio de controle não inoculado a três poços para servir como controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio (TSB e TSB + BS) a ser testado.
- Adicione 130 μL / poço de cultura inoculada em três poços e repita até que todas as condições experimentais sejam semeadas em triplicata.
- Incubar estaticamente durante 4 a 24 h a 37 °C.
- Usando um leitor de placas, registre o OD600. Defina os alvéolos de controle como 'em branco'. Confirme se o meio de controle está claro, sem evidência de turbidez. Se alguma turbidez for detectada, descarte o experimento. Os valores de OD600 podem ser usados para normalizar os dados se houver diferenças significativas na taxa de crescimento entre as cepas bacterianas.
- Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo, inclinando suavemente a placa e aspirando lentamente o meio na borda inferior do poço. Certifique-se de coletar todo o meio de cultura sem interromper a população bacteriana aderente localizada na superfície do plástico. Se a matriz de polissacarídeo extracelular (EPS) foi produzida durante o tempo de incubação, a matriz será visualizada como um precipitado branco. Não perturbe a matriz EPS.
- Lave suavemente os poços uma vez com 200 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.
- Inverta a placa para secar. Deixe secar no mínimo 20 min.
nota: Como o biofilme deve ser completamente seco antes da coloração, o protocolo pode ser pausado nesta etapa por algumas horas ou até mesmo durante a noite. O tempo de secagem adicionado não alterará o procedimento de coloração, enquanto a secagem incompleta afetará a quantificação dos resultados e a reprodutibilidade.
- Adicione 150 μL de violeta cristal a 0,5% a cada poço experimental e controle.
- Incube por 5 min em temperatura ambiente (RT).
- Lave os poços uma vez com 400 μL de água destilada. O volume adicionado ajuda a remover a mancha violeta cristalina residual das laterais dos poços. Remova a lavagem com a linha de vácuo.
- Lave os poços cinco vezes com 200 μL de água destilada. Remova a lavagem com a linha de vácuo.
nota: A lavagem completa é importante para a quantificação. Quando os poços em branco estiverem limpos da água destilada e não contiverem nenhuma mancha violeta cristalina residual, prossiga para a próxima etapa.
- Inverta a placa para secar, protegida da luz. Garanta a secagem completa da placa conforme indicado acima.
- Destain os poços com 200 μL de etanol a 95%. Incube a placa no shaker por 30 min. Para evitar a evaporação, especialmente em temperaturas mais altas, execute esta etapa a 4 °C.
- Usando um leitor de placas, registre a densidade óptica em 540 (OD540).
nota: O comprimento de onda para absorbância máxima do cristal violeta é próximo de 590 nm. A literatura relata uma faixa de OD540 - OD595 para absorbância de violeta de cristal; portanto, escolha um comprimento de onda disponível com base no leitor de placas.