1. Preparação de reagentes
- Meio de sais biliares (BS): Para preparar caldo de soja tríptico (TSB) contendo 0,4% de sais biliares (peso/volume), ressuspenda 200 mg de sais biliares em 50 mL de TSB autoclavado. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco médio semanal.
anotações: Os sais biliares usados rotineiramente são uma mistura 1:1 de colato de sódio e desoxicolato de sódio isolado de vesículas biliares ovina e bovina. Como demonstrado anteriormente, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. O TSB adicionou glicose em relação ao caldo Luria-Bertani (LB); e, portanto, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e nos demais patógenos entéricos analisados. Dependendo das bactérias a serem analisadas, podem ser necessárias diferentes concentrações de glicose ou diferentes necessidades de açúcar.
- 0,5% p/v de cristal violeta em água: Dissolva 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
- Concanavalina A () conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC): Reconstituir o estoque em 1x PBS. Diluir o estoque concentrado de 10 mg com 400 μL de 1x PBS até uma concentração final de 25 μg / mL e proteger da luz.
- PBS + Glicose: Dissolver 0,2 g de glicose em 10 mL 1x PBS (2% p/v de glicose final). Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- PBS + Sais biliares: Dissolva 40 mg em 10 mL 1x PBS (0,4% p / v sais biliares finais). Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- PBS + glicose e sais biliares: Dissolva 40 mg de sais biliares e 0,2 g de glicose em 10 mL 1x PBS (0,4% p / v de sais biliares e 2% p / v de glicose final). Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- Prepare placas de ágar LB.
- Correção de formaldeído/glutaraldeído: Adicione 810 μL de formaldeído (solução estoque a 37%, concentração final a 3%) e 125 μL de glutaraldeído (solução estoque a 25%, concentração final a 0,25%) a 14 mL 1x PBS. Homogeneizar e conservar a 4 °C. A correção deve ser fria para uso adequado.
cuidado: A correção é tóxica e requer descarte de resíduos perigosos.
- Solução de montagem antidesbotamento: Use uma solução de montagem antidesbotamento contendo corante de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para inibir o fotobranqueamento de amostras de microscopia imunofluorescente enquanto colore fluorescentemente o DNA da bactéria.
2. Preparação de Bactérias
- Cultive culturas noturnas das cepas bacterianas a serem testadas inoculando 3 mL de TSB com uma única colônia bem isolada em um tubo de cultura estéril. Incubar a 37 °C com agitação a 225 rpm para incubação durante a noite (16 - 24 h).
nota: As cepas devem ser retiradas novamente dos estoques do freezer a cada 2 a 4 semanas e mantidas em placas com no máximo 2 semanas de idade.
3. EPS Detecção de matriz
NOTA: Esses ensaios complementares quantificam e visualizam o EPS. Em ambos, o EPS é detectado usando uma lectina para ligar polissacarídeos. A proteína conjugada fluorescentemente permite a quantificação.
- Detecção semiquantitativa de EPS
- Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.
- Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS aos respectivos tubos.
- Inocular os tubos com 20 μL de cultura durante a noite (diluição de 1:50).
- Em uma placa estéril, preta, de fundo plano e tratada com cultura de tecidos de 96 poços, adicione 130 μL / poço de meio de controle não inoculado a três poços para servir como controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicione 130 μL / poço de cultura inoculada aos poços e repita até que todas as condições experimentais sejam semeadas em triplicata.
- Incubar estaticamente durante 4 a 24 h a 37 °C.
- Transfira o meio de cultura para uma placa transparente de 96 poços com uma pipeta, de preferência uma pipeta multicanal. Tenha cuidado para coletar todo o meio de cultura sem perturbar a população aderente e/ou o EPS localizado na superfície do plástico. Reservar.
- Fixe a placa preta por 15 min em RT usando 200 μL / poço de formaldeído / glutaraldeído em 1x PBS.
- Enquanto a população aderente está se fixando, avaliar a fração sobrenadante da etapa 1.1.6. Usando um leitor de placas, registre o OD600. Defina os alvéolos de controle como 'em branco'. Confirme se o meio de controle está claro, sem evidência de turbidez. Se alguma turbidez for detectada, descarte o experimento.
- Alternativamente, todo o ensaio pode ser realizado em uma placa inferior preta transparente. Nessas circunstâncias, os valores OD600 podem ser registados e o meio de cultura pode ser posteriormente eliminado antes de se proceder ao passo 3.1.7. Os valores de OD600 podem ser usados para normalizar os dados caso haja diferenças significativas na taxa de crescimento entre as cepas bacterianas.
- Remova a correção e descarte os resíduos perigosos.
- Lave suavemente os poços duas vezes com 200 μL/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo, inclinando suavemente a placa e aspirando lentamente a lavagem na borda inferior do poço.
- Adicionar 150 μL/alvéolo de 25 μg/ml de-FITC e incubar durante 15 min a RT.
- Lave suavemente duas vezes com 200 μL de PBS.
- Adicione 150 μL de PBS a cada poço. Registre a fluorescência em 488 nm.
