1. Preparação de reagentes
- Meio de sais biliares: Para preparar caldo tríptico de soja (TSB) contendo 0,4% de sais biliares (peso/volume), ressuspenda 200 mg de sais biliares em 50 mL de TSB autoclavado. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco médio semanal.
anotações: Os sais biliares usados rotineiramente são uma mistura 1:1 de colato de sódio e desoxicolato de sódio isolado de vesículas biliares ovina e bovina. Como demonstrado anteriormente, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. O TSB adicionou glicose em relação ao caldo Luria-Bertani (LB); e, portanto, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e nos demais patógenos entéricos analisados. Dependendo das bactérias a serem analisadas, podem ser necessárias diferentes concentrações de glicose ou diferentes necessidades de açúcar.
- 0,5% p/v de cristal violeta em água: Dissolva 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. O filtro esteriliza usando um filtro de 0,22 μm.
- Solução salina tamponada com fosfato (PBS) + Glicose: Dissolva 0,2 g de glicose em 10 mL 1x PBS (2% p / v de glicose final). O filtro esteriliza usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- PBS + Sais biliares: Dissolva 40 mg em 10 mL 1x PBS (0,4% p / v sais biliares finais). Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- PBS + glicose e sais biliares: Dissolva 40 mg de sais biliares e 0,2 g de glicose em 10 mL 1x PBS (0,4% p / v de sais biliares e 2% p / v de glicose final). O filtro esteriliza usando um filtro de 0,22 μm. Faça fresco no dia do uso.
- Prepare placas de ágar LB.
2. Preparação de Bactérias
- Cultive culturas noturnas das cepas bacterianas a serem testadas inoculando 3 mL de TSB com uma única colônia bem isolada em um tubo de cultura estéril. Incubar a 37 °C com agitação a 225 rpm para incubação durante a noite (16 - 24 h).
nota: As cepas devem ser retiradas novamente dos estoques do freezer a cada 2 a 4 semanas e mantidas em placas com no máximo 2 semanas de idade.
3. Ensaio de dispersão
NOTA: Neste ensaio, é detectada a desmontagem do biofilme por dispersão bacteriana. Aqui, os biofilmes maduros são estabelecidos e, posteriormente (geralmente no dia seguinte), os meios são substituídos por PBS ou PBS suplementado. O componente sobrenadante é então avaliado para quantificar o número de bactérias que se dissociaram do biofilme.
- Configure dois tubos de 1,5 mL. Rótulo com TSB ou TSB + BS (sais biliares).
- Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS aos respectivos tubos.
- Inocular os tubos com 20 μL de cultura durante a noite (numa diluição de 1:50).
- Em uma placa estéril, transparente, de fundo plano e tratada com cultura de tecidos de 96 poços, adicione 130 μL/poço de meio de controle não inoculado a três poços para servir como controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado.
- Adicionar 130 μL/alvéolo de cultura inoculada a três alvéolos e repetir até que todas as condições experimentais estejam semeadas em triplicata.
- Incubar a placa durante 4 - 24 h a 37 °C estaticamente.
- Antes de continuar, aqueça o PBS, PBS + glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose a 37 °C. Prepare esses reagentes frescos diariamente.
- Usando um leitor de placas, registre a densidade óptica, OD600. Defina os poços de controle como 'em branco'. Confirme se o meio está claro, sem evidência de turbidez. Se alguma turbidez for detectada, descarte o experimento. Os valores de OD600 podem ser usados para normalizar os dados se houver diferenças significativas na taxa de crescimento entre as cepas bacterianas.
- Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo. Certifique-se de coletar todo o meio de cultura sem interromper a população aderente localizada na superfície do plástico.
- Lave suavemente os poços duas vezes com 200 μL/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.
- Substitua a lavagem por 130 μL / poço do seguinte em três poços cada: PBS, PBS + glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose. Estes reagentes devem ser pré-aquecidos a 37 °C.
- Incubar a placa durante 30 min a 37 °C.
- Remova cuidadosamente a placa da incubadora a 37 °C. Transfira os sobrenadantes para uma placa fresca e estéril de 96 poços.
- Usando uma placa de 96 poços ou bloco de diluição, prepare diluições seriadas de 10 vezes (1:10) do sobrenadante em PBS estéril.
nota: A série de diluições deve variar entre não diluída e 10-6, dependendo da estirpe bacteriana a ensaiar. Experimentos piloto podem ser realizados para determinar a faixa de diluição ideal.
- Colocar 5 μL de cada diluição em ágar-LB utilizando uma pipeta multicanal. Incubar a 37 °C durante a noite. Contar as colónias no dia seguinte e ter em conta o factor de diluição para determinar as unidades formadoras de colónias de recuperação (UFC). Para calcular a dispersão percentual em relação ao controle 1x PBS (definido em 100%), divida a UFC de recuperação de cada condição de tratamento pela UFC de recuperação da amostra controle 1x PBS.
nota: Placas de mídia de rotina para a cepa bacteriana de interesse também podem ser usadas. Por exemplo, Shigella pode ser banhada em placas vermelhas do Congo. Certifique-se de que as placas estejam secas para técnicas de revestimento por pontos apropriadas.
