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1. Preparação de um biofilme in vitro de bactérias na colônia fúngica
- Centrifugue a cultura bacteriana a 5.000 x g por 3 min e suspenda o pellet em 25 ml de tampão fosfato de potássio estéril 0,1 M (25 g / L KH2PO4 e 2,78 g / L K2HPO4, pH 5,8). Repita esta etapa uma vez e ajuste a concentração bacteriana final para 109 células/ml com o mesmo tampão.
- Encha uma microplaca de 6 poços com 5 ml da suspensão bacteriana (ou tampão estéril de fosfato de potássio 0,1 M para o controle negativo).
- Corte a membrana de celofane da cultura fúngica com uma lâmina de barbear estéril para obter quadrados de celofane com uma única colônia de fungos em cada membrana. Remova cuidadosamente os quadrados de celofane contendo hifas do meio sólido usando uma pinça e transfira o quadrado de celofane contendo hifas para um poço da microplaca contendo a suspensão bacteriana.
- Agite suavemente a microplaca enquanto as colônias de fungos ainda estão presas ao celofane; em seguida, remova as folhas de celofane, deixando as colônias de fungos na placa.
- Incubar a microplaca com agitação suave (~60 rpm) a uma temperatura adaptada aos microrganismos estudados.
nota: O tempo de incubação depende da velocidade de estabelecimento do biofilme e do estágio a ser analisado. Para P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incube a 20 ° C por 30 min para obter biofilmes em estágio inicial e até 16 horas para obter biofilmes maduros.
2. Análise de Microscopia Confocal de Varredura a Laser da Formação de Biofilme
- Preparação da amostra
- Para remover bactérias planctônicas e bactérias eletrostaticamente ligadas às hifas, enxágue o fungo transferindo-o para uma nova microplaca de 6 poços cheia de 5 ml de uma solução salina forte (NaCl, 17 g / L); agite suavemente por 1 min.
- Transfira o fungo para uma nova microplaca de 6 poços contendo 5 ml de tampão fosfato de potássio estéril 0,1 M, agite suavemente por 2 min e transfira o fungo para tampão de fosfato de potássio fresco.
- Corte a parte da colônia fúngica a ser visualizada com um bisturi, mantendo-a no tampão fosfato de potássio, de modo que a seção obtida contenha cerca de metade da colônia fúngica.
- Para corar a amostra, transfira-a para uma placa de Petri cheia de água estéril contendo um corante fluorescente apropriado (dependendo do objetivo da análise) e incube-a no escuro.
- Para visualizar a rede fúngica, use, por exemplo, Congo Red (concentração final de 0,1%, 5 min de incubação), lectina aglutina de gérmen de trigo (WGA) conjugada a Alexa Fluor 633 (concentração final de 10 μg/ml, 10 min de incubação) ou FUN1 (concentração final de 10 μM, 10 min de incubação).
- Se estiver usando uma bactéria marcada com não fluorescência, contra-core as células bacterianas com uma sonda fluorescente específica para DNA entre os numerosos corantes de DNA com células disponíveis comercialmente. Por exemplo, use DAPI (concentração final de 0,25 μg/ml, 10 min de incubação).
- Para visualizar as proteínas da matriz, use uma coloração de proteína.
- Após a coloração, enxágue a amostra transferindo-a para uma tampa de placa de Petri contendo 10 ml de fosfato de potássio estéril 0,1 M e agite suavemente por 1 min.
- Mergulhe uma lâmina na tampa da placa de Petri e traga delicadamente a seção cortada para flutuar acima da lâmina. Em seguida, remova lentamente a lâmina da solução tampão, permitindo que a amostra assente suavemente na lâmina.
nota: Para esta etapa, é muito importante proceder com cuidado para evitar distúrbios do biofilme.
- Por fim, adicione 10 μl de meio de montagem anti-desbotamento à amostra e cubra-a com uma lamínula de vidro.
nota: Uma vez preparada a lâmina, a análise microscópica deve ser realizada o mais rápido possível (no máximo 30 minutos) para evitar modificações na estrutura do biofilme.