Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal

Resumo

Fonte: Peranzoni, Elisa, et al. Ex vivo Imaging de linfócitos T CD8 residentes em fatias de tumor de pulmão humano usando microscopia confocal. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo descreve a imagem de células T CD8 infiltrantes de tumor residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatias de tumor de pulmão humano. Essa técnica permite análises em tempo real da migração de células T CD8 por meio de microscopia confocal.

Protocolo

1. Imunomarcação de células T CD8 residentes e células tumorais

1. Diluir os anticorpos (concentração final de 10 μg/mL) e o corante nuclear (concentração final de 1 μg/mL) em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol.
   nota: Use anticorpos anti-CD8 (IgG murina, clone SK1) e anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) (IgG murina HEA-125) acoplados fluorescentemente para marcar linfócitos T CD8 e células epiteliais tumorais, respectivamente. Use anticorpo anti-CD90/Thy1 acoplado fluorescentemente (IgG murino, clone 5E10) para marcar fibroblastos e células endoteliais ativadas. Use 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar o núcleo das células com uma membrana plasmática comprometida para avaliar a viabilidade do tecido.
2. Remova as placas de cultura da incubadora e use uma pipeta para aspirar qualquer líquido dentro das arruelas de aço inoxidável. Não remova o meio RPMI-1640 de 1.1 mL colocado sob as inserções de cultura de células.
3. Sem tocar na fatia e usando uma ponta de pipeta, adicione 40 μL da solução contendo os anticorpos em cada fatia do tumor.
4. Incubar a placa a 37 °C durante 15 min para permitir a coloração de anticorpos.
5. Com pinças finas, remova as arruelas, retire as fatias e mergulhe-as por 10 s em meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol. Coloque as fatias de volta nas inserções de cultura de células e adicione uma gota de meio RPMI-1640 sem vermelho de fenol em cada fatia individual. Manter a placa a 37 °C durante 10 min. Prossiga para a imagem.

2. Imagem e análise da migração de células T CD8 residentes em fatias de tumor de pulmão humano

NOTA: O microscópio confocal usado neste protocolo é um disco giratório vertical equipado com uma objetiva de imersão em água de 25x (25x/0.95 NA).

1. Preparando a configuração do microscópio
   1. Regular a temperatura da câmara de calor do microscópio a 37 °C algumas horas antes de iniciar a sessão de imagiologia.
   2. Configure um sistema para perfundir constantemente fatias tumorais com meio RPMI oxigenado (5% CO₂, 95% O₂) sem vermelho de fenol (Figura 1). Use uma bomba peristáltica para fluir o meio de perfusão para a câmara de imagem e aspire a solução para um balão de coleta de resíduos.
   3. Opere a bomba peristáltica para permitir que a solução oxigenada passe pelos tubos de perfusão.
2. Com uma pinça fina, retire a fatia da placa de 6 poços e transfira-a para a placa de plástico de 35 mm cheia de meio RPMI sem vermelho de fenol. Imobilize a fatia com uma âncora de fatia de 19,7 mm de diâmetro com roscas espaçadas de 2 mm. Coloque a placa de Petri no estágio de imagem do microscópio. Conecte as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão. Ligue o sistema de perfusão e defina a taxa de fluxo do meio para 0.8 mL / min.
3. Abaixe a objetiva de imersão em água até a fatia. Concentre-se na parte superior da fatia com luz de campo brilhante. Usando luz fluorescente apropriada, selecione uma região de interesse que contenha células T CD8, ilhotas tumorais (positivas para EpCAM) e uma área de estroma (positiva para CD90). Verifique a viabilidade das células dentro da fatia avaliando a coloração DAPI na superfície de corte e mais profundamente no tecido.
   NOTA: Uma fatia saudável contém apenas uma minoria de células positivas para DAPI a vários mícrons da superfície de corte.
4. Defina uma sessão de imagem com as seguintes ações.
   1. Dependendo da intensidade do sinal fluorescente dos 3 fluoróforos, defina o tempo de exposição entre 50 a 800 ms e a intensidade do laser entre 20 a 40%.
   2. Selecione a espessura da pilha z para obter a imagem dentro da fatia do tumor.
      nota: Aqui, 10-12 planos ópticos abrangendo uma profundidade total de 60-70 μm na dimensão z foram capturados.
   3. Selecione a posição inicial aproximadamente 10 μm abaixo das primeiras células T CD8 marcadas.
   4. Defina o intervalo de tempo entre cada imagem z-stack entre 10 a 30 s e o tempo total de gravação entre 10 a 30 min.

Resultados

Figura 1: Fotografias do sistema de perfusão. A) A solução de RPMI sem vermelho de fenol é enriquecida em 5% de CO₂, 95% de O₂. B) A solução é então perfundida por uma bomba peristáltica. C) A solução RPMI entra na placa de cultura através da entrada. Na saída, a solução é aspirada pela bomba da câmara para um recipiente de resíduos. Observe que a ponta de aspiração é ajustada e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio confocal vertical	Leica	Recomenda-se o uso de um confocal de disco giratório
Software Imaris	Plano de bits		Este software é usado para visualização de imagens e rastreamento da migração de células T
Fórceps Fino	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 14142
Insertos de cultura de 30 mm	Millipore	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio, suplemento GlutaMAX	ThermoFisher	61870010	O meio RPMI completo é obtido pela adição de 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor e penicilina/estreptomicina
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher	20012019
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)	Invitrogen	14170088
Baixa temperatura de gelificação Agarose, tipo VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Cola de cianoacrilato butílico não tóxico, Vetbond	3m	1469
Âncoras de fatia, 19,7 de diâmetro, espaçamento de 2 mm	Warner Instruments	Telefone: 64-1415
Arruelas de aço inoxidável, 5 mm de diâmetro interno	amazona	B004K1FDGQ
Anti-CD8 conjugado com BV605 (clone SK1)	BD Biociências	565289
Anti-EpCAM conjugado com FITC (clone HEA-125)	Miltenyi Biotec	130-098-113
Anti-CD90 conjugado com BV510 (clone 5E10)	Biolenda	328125
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI	ThermoFisher	D1306