NOTA: Este protocolo enfatiza o uso de citometria de fluxo FRET para detectar atividade de semeadura de amostras biológicas de camundongos. Também é compatível com fibrilas recombinantes e amostras biológicas humanas. A eutanásia em camundongos e a coleta de cérebros foram realizadas de acordo com os procedimentos aprovados pela IACUC.
1. Extração de cérebro
- Após anestesia profunda com isoflurano (2%), perfundir um camundongo com PBS gelado contendo 0,03% de heparina e extrair o cérebro seguindo os detalhes descritos em Gage et al.
- Coloque o tecido extraído em um frasco criogênico e congele colocando nitrogênio líquido. Como alternativa, congele o tecido em gelo seco. Depois de congelado, transfira o tecido para -80 °C e armazene por um longo período de tempo, se necessário.
nota: Este protocolo é compatível com homogeneizados cerebrais inteiros ou regiões cerebrais microdissecadas. Veja Hagihara et al.para um protocolo detalhado de microdissecação.
2. Preparação de Material Biológico de Sementes
- Prepare o tampão de homogeneização dissolvendo inibidores de protease (ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) livre) em 1x TBS (solução salina tamponada com Tris, 1 comprimido por 10 ml). Vortex vigorosamente e armazene no gelo. Os inibidores de protease devem ser livres de EDTA para preservar a viabilidade das células do biossensor.
- Pesar o tecido cerebral congelado num recipiente de pesagem descartável e transferir para um tubo cónico de 5 ml. Adicione tampão de homogeneização gelado de modo que a solução final seja de 10% de peso / volume. Armazene temporariamente no gelo. A massa do tecido e o volume tampão de homogeneização subsequente variam dependendo do tamanho do cérebro e/ou das regiões usadas. Aqui, um hemicérebro de camundongo adulto pesando 0,2 g é suspenso em 2 ml para uma solução a 10% p / vol.
- Transfira as amostras para uma câmara fria e ajuste um sonicador de sonda para as configurações apropriadas. Para sonicação da sonda com um Omni Ruptor (mostrado aqui), defina a potência para 20%, o que corresponde a aproximadamente 75 W. Use um modo de pulso para garantir que as amostras não sejam superaquecidas durante a sonicação. Defina o pulsador para 30%, correspondendo a aproximadamente 500 mseg.
- Limpe a ponta do sonicador da sonda enxaguando com água, isopropanol e água novamente, limpando a sonda entre cada solução. Certifique-se de enxaguar e limpar as laterais e a parte inferior da sonda com lenços umedecidos.
- Trabalhando com uma amostra de cada vez, mergulhe a ponta da sonda no tampão de homogeneização e inicie o sonicador. Usando as configurações de potência e pulsador descritas acima, forneça 25 pulsos no total. Certifique-se de que o tecido esteja completamente em suspensão. Tenha cuidado para evitar a formação de espuma da amostra durante esta etapa.
nota: As amostras são suscetíveis à formação de espuma se a) o volume total for baixo ou b) o homogeneizado aquecer. Com este instrumento específico, não sonicar com volumes inferiores a 250 μl. Para garantir que as amostras permaneçam resfriadas, os tubos podem ser armazenados no gelo durante esta etapa.
- Limpe a sonda limpando o lisado residual e, em seguida, forneça 10 pulsos em um béquer de água limpa. Enxágue as laterais e a parte inferior da sonda com água, isopropanol e água novamente (como na etapa 2.4), secando entre cada etapa. Para evitar contaminação, enxágue bem a sonda entre as amostras.
nota: Com agregados tau, não descobrimos que métodos de limpeza mais rigorosos são necessários para evitar a contaminação de amostra para amostra. Outros amiloides, no entanto, podem exigir cuidados adicionais que foram amplamente descritos na literatura.
- Armazene homogeneizados no gelo até que todas as amostras tenham sido processadas.
- Homogeneizar a rotação a 21.300 x g por 15 min a 4 °C.
- Transferir o sobrenadante para um tubo limpo, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento. Descarte o pellet. Alíquota do sobrenadante e armazenar lisados a -80 °C para posterior utilização. Evite ciclos de congelamento / descongelamento dos homogeneizados, no entanto, pois isso reduz a eficiência da semeadura.
3. Replaqueamento de células biossensoriais
NOTA: Use quatro linhas celulares para este ensaio: HEK 293T (linha celular #1), RD-P301S-CFP (linha celular #2), RD-P301S-YFP (linha celular #3) e RD-P301S-CFP/YFP (linha celular #4). Consulte a Tabela de referência 1 para a contribuição de cada linha celular para o ensaio.
- Em um ambiente estéril, aspire o meio de cultura. Enxágue as células com solução salina tamponada com fosfato quente (PBS) e aspire. Tripsinize as células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) por 3 min, tempere com meio de cultura quente (9 ml de DMEM, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de GlutaMax) e transfira imediatamente as células para um tubo cônico.
- Centrifugue as células a 1.000 x g por 5 min em RT. Aspire o meio e ressuspenda o pellet celular em meio de cultura quente.
- Usando um hemocitômetro, determine a densidade celular de cada linhagem celular. A densidade celular varia de acordo com a confluência no momento da colheita e do volume de ressuspensão. Ressuspenda as células colhidas de uma placa de 10 cm a 90% de confluência em meio de 10 ml, para que a densidade celular seja de aproximadamente 1 milhão de células / ml.
- Faça uma mistura mestre de células + meio de modo que cada poço de uma placa de 96 poços contenha 35.000 células em meio de 130 μl (por exemplo, para fazer uma mistura mestre para 100 poços, ressuspenda 3,5 milhões de células em meio de 13 ml). Modifique o número da célula para se adequar a projetos experimentais e cronogramas individuais. Para tratamento celular ~ 18 horas após o reforço, adicione 35.000 células a cada poço de uma placa de 96 poços.
- Usando uma pipeta multicanal, pipete lentamente 130 μl de suspensão de células master mix em cada poço de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo plano. Durante o revestimento, coloque a ponta da pipeta no centro do poço, sem tocar no fundo da placa.
nota: Embora o formato do plaqueamento possa ser modificado, recomenda-se fazer n = 4 poços para cada uma das linhagens celulares 1-3 por placa. O restante da placa (n = 84) é reservado para a linha celular #4 (células biossensoras).
- Deixe as células assentarem deixando a placa intacta por 10 min em RT. Incube O/N a 37 °C, 5% de CO2 e ≥80% de umidade relativa.
4. Tratamento de células
NOTA: No dia seguinte, quando as células do biossensor tau estiverem 60-65% confluentes, prepare os complexos de transdução de sementes da seguinte forma:
- Em um tubo, combine o reagente de transfecção, como a lipofectamina, com meios de soro reduzido, como o Opti-MEM, para fazer uma mistura mestre. Por poço, adicione 1,25 μl de reagente de transfecção e 8,75 μl de meio de soro reduzido. Agite o tubo suavemente para misturar, gire brevemente para baixo e incube por 5 min em RT.
- Em outro tubo, combine o material da semente (alíquota do lisado da etapa 2.9) com meios de soro reduzido.
nota: O volume do material da semente varia de acordo com o experimento individual. Ao escolher o volume de sementes, leve em consideração: abundância de sementes em uma amostra e potencial toxicidade. Os homogeneizados brutos podem ser tóxicos para as células. Como tal, use o volume mais baixo possível para monitorar o efeito desejado. Os volumes de lisado / poço testados anteriormente variam de 1-5 μl, correspondendo a 5-20 μg de proteína total. Certifique-se de que o volume total por alvéolo (sementes + meio de soro reduzido) é de 10 μl.
- Combine o conteúdo dos dois tubos descritos em 4.1 e 4.2, agite suavemente para misturar, gire brevemente para baixo (1.000 x g, 5 seg) e incube em RT por pelo menos 20 min e até 2 horas.
- Pipetar suavemente 20 μl de complexo de transdução na lateral de poços de biossensores individuais. Use três réplicas técnicas, se possível. Devolva as células tratadas à incubadora por 24-48 horas. Incubar nas mesmas condições descritas na etapa 3.6.
nota: A condição de controle negativo apropriada para esta configuração são as células biossensoriais tratadas com lipossomas vazios (ou seja, reagente lipossomal + meio sérico reduzido) porque a aplicação de fosfolipídios introduz uma ligeira mudança no perfil de fluorescência em relação às células biossensoriais não expostas ao reagente liposssomal.
5. Colheita de células para citometria de fluxo FRET
NOTA: Antes da colheita de células - geralmente 24-48 horas após o tratamento - é possível obter uma leitura preliminar da atividade de semeadura usando o filtro de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio de fluorescência invertida padrão. As células tratadas sem material de semente (ou seja, lipossomas vazios) apresentarão fluorescência difusa, enquanto as células tratadas com material de semente apresentarão intensas inclusões intracelulares pontilhadas e reticulares (Figura 1A-B).
- Aspirar todo o meio celular (150 μl) com uma pipeta multicanal. Tripsinize (50 μl) células por 5 min e resfrie com 150 μl de meio de cultura resfriado. Não inclua um enxágue com PBS antes da tripsinização nesta etapa, pois pode causar elevação celular e subsequente perda celular. Exclua quaisquer células mortas e detritos contaminantes durante a citometria de fluxo por meio de estratégias de gating.
- Imediatamente após a têmpera, transfira as células para uma placa inferior redonda de 96 poços e centrifugue a 1.000 x g por 5 min em RT.
- Aspire e descarte o meio, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Suavemente, mas completamente, ressuspenda o pellet celular em 50 μl de paraformaldeído a 2% e incube por 10 min. Como alternativa, execute as células ao vivo, embora a fixação forneça resultados mais limpos e consistentes.
- Centrifugue as células a 1.000 x g por 5 min em RT. Aspire e descarte o paraformaldeído, tomando cuidado para evitar perturbar o pellet celular.
- Ressuspenda suavemente, mas completamente, o pellet celular em tampão de citometria de fluxo resfriado de 200 μl (solução salina balanceada de Hanks (HBSS), 1% FBS, 1 mM EDTA) e execute a placa o mais rápido possível para evitar a aglomeração celular.
6. Citometria de fluxo FRET
NOTA: Use um citômetro de fluxo como o MACSQuant VYB, que é equipado com linhas de laser compatíveis com FRET e conjuntos de filtros (Tabela 2). Para cada etapa desta seção, clique no poço de interesse usando o modelo de 96 poços do software e clique em "reproduzir" para iniciar a captação e o fluxo da amostra. Faça gráficos ou tabelas estatísticas clicando no ícone 'nova janela de análise'. Altere os parâmetros do eixo em gráficos bivariados individuais clicando no título no eixo X ou Y e selecionando o filtro apropriado. Para mudar as populações de células ou os sinais de fluorescência, aumente ou diminua as tensões associadas aos filtros apropriados. Com este instrumento, execute < 1.000 eventos/s para garantir um monitoramento preciso de uma única célula.
- Faça um gráfico bivariado de Área de Dispersão Lateral (SSC-A) vs Área de Dispersão Direta (FSC-A) e, com a linha celular #1 em execução, ajuste as tensões SSC e FSC até que a população de células esteja no quadrante inferior esquerdo. Clique na ferramenta de polígono e defina a população de células (Portão P1). Para todos os parâmetros de gating, consulte a Figura 2.
- Faça um gráfico bivariado FSC-H (altura) vs FSC-A e aplique o Portão P1 a este gráfico clicando em "ao vivo" acima do gráfico e selecionando P1. Com a linha de célula #1 em execução, clique na ferramenta polígono e defina células únicas (Porta P2).
- Faça 3 gráficos de histograma, um para cada um dos filtros de interesse: CFP, YFP e FRET. Aplique a Porta P2 a todas essas parcelas clicando em "ao vivo" acima das parcelas e selecionando P2. Com a linha celular #1 em execução, ajuste as tensões de modo que a população média de células nos histogramas CFP, YFP e FRET esteja entre 0 e 1. Para medir CFP e FRET, excite as células com o laser de 405 nm e capture a fluorescência com um filtro de 450/50 nm e 525/50 nm, respectivamente. Para medir o YFP, excite as células com um laser de 488 nm e capture a fluorescência com um filtro de 525/50 nm. As configurações do laser e do filtro são descritas em mais detalhes na Tabela 2.
- Realizar a compensação do transbordamento de CFP para os canais FRET e YFP.
nota: A compensação é o processo de correção do transbordamento de fluorescência. O transbordamento de fluorescência ocorre sempre que a emissão de fluorescência de um fluorocromo é detectada dentro de um filtro projetado para medir o sinal de outro fluorocromo. Com a compensação adequada, a fluorescência de transbordamento CFP pode ser removida dos canais FRET e YFP.
nota: A compensação requer a presença de células positivas e negativas para fluorescência. Assim, para compensar as células positivas para CFP (linha celular #2), as células negativas (linha celular #1) devem ser adicionadas à amostra antes da execução.
- Pico em 30 μl de suspensão da linha celular # 1 de um único poço em 200 μl de suspensão da linha celular # 2 imediatamente antes da compensação.
- Clique no ícone "Configurações do instrumento", depois na guia 'compensação' e marque 'matriz' para abrir a tabela de compensação.
- Faça um gráfico bivariado FRET-A vs CFP-A e aplique a porta P2, conforme descrito na etapa 6.3. Com as linhas celulares 1+2 em execução, clique no ícone 'quadrante' e desenhe quadrantes de forma que as populações de fluorescência negativa e positiva sejam separadas pelos dois quadrantes inferiores (Gates LL3 e LR3, respectivamente).
- Crie uma tabela de estatísticas que exiba a intensidade média de fluorescência (MFI) do FRET para as portas LL3 e LR3. Ajuste o parâmetro FRET na matriz de compensação até que o MFI do sinal FRET seja equivalente entre LL3 e LR3. Após esta etapa, o MFI do sinal FRET é igual entre células não coradas e células positivas para CFP, sugerindo a ausência de transbordamento de CFP para o canal FRET.
- Faça um gráfico bivariado YFP-A vs CFP-A e aplique a porta P2, conforme descrito na etapa 6.3. Desenhe quadrantes (LL4 e LR4) semelhantes aos feitos na etapa 6.4.3.
- Crie uma tabela de estatísticas que exiba o MFI do YFP para LL4 e LR4. Ajuste o parâmetro YFP na matriz de compensação até que o MFI do sinal YFP seja equivalente entre LL4 e LR4. Após esta etapa, o MFI de um sinal YFP é igual entre células não coradas e células positivas para CFP, sugerindo a ausência de transbordamento de CFP para o canal YFP.
- Após a configuração e compensação do portão, destaque os poços de interesse e execute o restante da placa.
- Depois que todas as amostras forem executadas, exporte os arquivos de dados clicando em 'arquivo' e depois em 'copiar'. Selecione a guia 'arquivos de dados', destaque a pasta do experimento e clique em 'copiar'.
