Uma técnica para avaliar o efeito inibitório da exposição a toxinas em correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura (mEPSCs)

Resumo

Fonte: Hubbard, K. et. al., Avaliação Funcional de Neurotoxinas Biológicas em Culturas em Rede de Neurônios do Sistema Nervoso Central Derivados de Células-Tronco.J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra a análise eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco embrionárias após exposição a neurotoxinas. O tratamento desses neurônios com neurotoxinas botulínicas reduz a frequência de correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas em miniatura, confirmando a inibição da transmissão sináptica.

Protocolo

1. Adaptação de células-tronco embrionárias (ESCs) à cultura de suspensão livre de células alimentadoras

1. Descongele os ESCs a 37 °C até que reste uma lasca de gelo.
2. Usando uma pipeta P1000, transfira suavemente 1 - 2,5 x 10⁶ ESCs dissociadas para um prato não tratado com cultura de tecidos contendo 10 ml de meio ESC pré-aquecido. Incubar em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada por 20 horas a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO₂).
3. Após 20 horas, lavar as células transferindo suavemente a cultura em suspensão para um tubo cónico de 15 ml utilizando uma pipeta serológica de 10 ml. ESCs de pellets por 3 min a 200 x g. Durante a centrifugação, adicione 10 ml de ESC fresco de média a baixa aderência.
4. Aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado de não desalojar o sedimento celular, e adicionar 1 ml de meio ESC fresco ao sedimento celular. Transfira as células para a placa bacteriana usando uma pipeta P1000 e retorne à incubadora.
5. Observe as células diariamente até que os agregados se tornem visíveis a olho nu (normalmente 4 a 8 dias (d); os agregados serão de 0,2 a 0,5 mm). Se os agregados não forem aparentes após 4 d, repita a etapa 1.3. Uma vez visíveis os agregados, dissociar e manter as CTEs conforme descrito na Seção 2.

2. Aprovação e Manutenção do ESC

1. Transfira os agregados ESC para um tubo cônico de 15 ml usando uma pipeta estéril de 10 ml e deixe os agregados assentarem em um pellet compacto (normalmente 3 a 5 min). Aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento celular, e lavar os agregados com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Embora a sedimentação por gravidade seja recomendada, alternativamente, células de pellets a 100 x g por 2,5 min para economizar tempo.
2. Aspirar PBS e adicionar 500 μl de tripsina. Incubar os agregados em tripsina durante 3 min em banho-maria a 37 °C. Adicionar 500 μl de meio ESC para diluir a tripsina e triturar suavemente 10 vezes com uma pipeta P1000 para quebrar os agregados. Conte as células usando um hemocitômetro.
3. Células dissociadas em pellets por 3 min a 200 x g e ressuspendem as células até uma concentração final de 1,0 x 10⁷ células / ml em meio ESC. Transferir 150 μl (1,5 x 10⁶ células) para 10 ml de meio ESC fresco numa placa bacteriana de 10 cm e voltar à incubadora de cultura de tecidos durante 48 horas. O excesso de ESCs pode ser diferenciado, criopreservado a 1 - 5 x 10⁶ células / ml em meio ESC a 90% suplementado com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ou descartado.
4. Agregação de passagem a cada 48 horas. Os agregados prontos para passagem serão claramente visíveis, com diâmetros superiores a 0,5 mm.
   nota: O descongelamento e a cultura de células criopreservadas e adaptadas à suspensão são realizados de acordo com as etapas 1.2 - 1.4. Os agregados estarão prontos para passagem dentro de 48 a 72 horas.

3. Diferenciação Neuronal

NOTA: Execute as etapas 3.1 a 3.5 antes do meio-dia e as etapas 3.7 após o meio-dia. Uma visão geral dos procedimentos de diferenciação é apresentada na Figura 1A.

1. Dissocie as ESCs como nas etapas 2.1 a 2.5. Transferir 350 μl (3,5 x 10⁶) de ESCs dissociados para uma cápsula de baixa fixação de 10 cm contendo 25 ml de meio de diferenciação. Colocar num agitador orbital regulado para 30 - 45 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO₂. Este é o primeiro dia de diferenciação, denominado dia in vitro (DIV) -8.
   nota: O uso de uma placa de fixação ultrabaixa aumenta o custo do método, mas produz rendimentos ligeiramente maiores do que as placas de Petri bacterianas, uma vez que os agregados podem ocasionalmente aderir às placas de Petri. Volumes médios e números de células podem ser dimensionados de acordo se diferentes tamanhos de pratos forem preferidos.
2. Após 48 horas (DIV -6), utilizar uma pipeta de 25 ml para transferir os agregados celulares diferenciadores para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar imediatamente 25 ml de meio de diferenciação à placa de Petri.
3. Deixe os agregados assentarem por 2 a 5 min, produzindo um pellet visível com 1 a 2 mm de profundidade. Ignore células individuais ou pequenos agregados que permanecem em suspensão. Aspirar cuidadosamente o meio e transferir o sedimento celular de volta para a placa de Petri utilizando um P1000. Coloque no agitador rotativo em uma incubadora de cultura de tecidos.
4. Em DIV -4, repita a etapa 3.2. O pellet terá 2 a 4 mm de profundidade. Substituir 30 ml de meio de diferenciação suplementado com 6 μM de ácido all-trans-retinóico (RA) na placa de Petri. Retorne ao agitador rotativo na incubadora de cultura de tecidos por mais 48 horas.
5. No DIV -2, repita a etapa 3.3. O pellet terá 4 a 8 mm de profundidade neste ponto.
6. No DIV -1, prepare as superfícies de revestimento como na Seção 4.
7. No DIV 0, descongelar 5 ml de meio de tripsinização de células progenitoras neurais (NPC) pré-aliquotadas e congeladas a 37 °C durante 5 a 10 min e colocar numa capa de cultura de tecidos. Com uma pipeta de 25 ml, transferir os agregados diferenciadores para um tubo cónico de 50 ml. Deixar assentar os agregados e aspirar cuidadosamente o meio. Lavar o pellet duas vezes com 10 ml de PBS, permitindo que os agregados assentem entre as lavagens.
8. Após a segunda lavagem com PBS, adicione 5 ml de meio de tripsinização NPC ao pellet e incube a 37 °C durante 5 min. Agite suavemente o tubo após 2,5 min.
9. Adicione 5 ml de inibidor de tripsina de soja (STI) a 0,1% para inativar a tripsina e misture invertendo. Triturar suavemente 10 a 15 vezes com uma pipeta serológica de 10 ml até obter uma suspensão celular relativamente homogénea.
10. Transferir lentamente a suspensão celular para um filtro de células de 40 μm ou 70 μm colocado na parte superior de um tubo cónico de 50 ml. Uma vez filtrada toda a suspensão, adicionar 1 ml de meio N2 para lavar as células restantes através do filtro e aplicar um pellet na suspensão de células dissociadas durante 6 min a 200 x g.
11. Aspirar o meio sem perturbar o pellet. Lave as células duas vezes com 10 ml de meio N2, células de pellets por 5 min a 200 x g e triture entre as lavagens com um P1000. Antes da segunda lavagem, conte as células usando um hemocitômetro.
12. Ressuspender células em meio N2 a 1 x 10⁷ células por ml e colocar neurônios derivados de células-tronco embrionárias (ESNs) em placas com uma densidade celular de 150.000 - 200.000 células / cm².
13. Transferir ESNs recém-plaqueados para uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ e manter como na Seção 5.

4. Preparando superfícies de cultura para o revestimento de precursores neurais no DIV 0

1. Prepare pratos tratados com cultura de tecidos pelo menos 1 dia antes do revestimento. Adicionar polietilenoimina (PEI; 25 μg/ml em H₂O estéril) ou poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml em H₂O estéril) suficiente para cobrir as placas de plástico tratadas com cultura de tecidos e incubar O/N a 37 °C.
2. Na manhã do revestimento, lave a louça duas vezes com H₂O bidestilado e uma vez com PBS. Após a lavagem final, adicione meio N2 suficiente para cobrir o prato (por exemplo, 1 ml por poço de um prato de 12 poços ou 4 ml por prato de 6 cm).
3. Preparar lamínulas de vidro de 18 mm pelo menos um dia antes da placa dos neurónios. Limpe as lamínulas por limpeza de plasma por 4 min.
4. Transferir imediatamente as lamínulas limpas para um parafilme lavado com etanol no fundo de uma placa grande e estéril e adicionar 400 μl de solução de PEI ou PDL, preparada como no passo 4.1. Incubar durante a noite (O/N) a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecidos.
5. De manhã, lave as lamínulas três vezes com água e adicione 5 μg / ml de laminina em PBS por 1 a 3 horas a 37 ° C. Antes de dissociar os neurônios, aspire a laminina e transfira imediatamente a lamínula para um poço de uma placa de 12 poços contendo 1 ml de meio NPC, certificando-se de manter o lado tratado voltado para cima.
6. Armazene pratos e lamínulas a 37 ° C até que os NPCs estejam prontos para o prato.

5. Manutenção de Neurônios

1. No DIV 1, aspirar o meio e substituí-lo pelo meio de cultura N2.
2. Nos DIV 2 e 4, aspirar o meio e substituí-lo por meio de cultura B27.
3. No DIV 8, aspire o meio e substitua por meio de cultura B27 contendo inibidores mitóticos para eliminar as células não neuronais contaminantes.
4. Na DIV 12, substitua por meio de cultura B27.
5. Não remova DIV 12⁺ ESNs de 5% CO₂ até que esteja pronto.

6. Ensaio de Inibição Medida da Transmissão Sináptica (MIST) para Quantificar Correntes Pós-sinápticas Excitatórias em Miniatura

CUIDADO: As neurotoxinas clostridiais são as substâncias mais venenosas conhecidas, com valores estimados de LD₅₀ humanos tão baixos quanto 0,1 - 1 ng/kg. Obtenha as aprovações necessárias antes de usar essas toxinas e tome as devidas precauções.

1. Diluir cuidadosamente BoNT/A a 100x, a concentração final desejada no meio de cultura ESN, e aquecer a 37 ºC. Adicionar o volume apropriado de toxina às culturas DIV 21+ ESN, agitar a placa de cultura e retornar à incubadora.
2. Se as células forem analisadas mais de 4 horas após a intoxicação, adicione uma toxina ao prato e agite sem remover de 5% de CO₂, como diretamente na incubadora ou em uma câmara de CO₂ constante.
3. No momento apropriado, aspirar o meio de cultura ESN e lavar duas vezes com tampão de registo extracelular (ERB). Adicione 4 ml de ERB suplementado com 5,0 μM de tetrodotoxina e 10 μM de bicuculina, bloqueando os potenciais de ação e antagonizando a atividade_do receptor GABA A, respectivamente.
4. Transfira o prato para o equipamento de eletrofisiologia. Nem a perfusão nem o controle de temperatura são necessários para o ensaio MIST.
5. Puxe o vidro de borossilicato usando um extrator de micropipeta para produzir uma pipeta de registro com 5-10 mΩ de resistência e encha com tampão de registro intracelular. Mergulhe suavemente a pipeta de gravação cheia no reagente siliconizante antes de gravar.
6. Usando uma seringa cheia de ar, forneça pressão positiva enquanto a pipeta de registro é abaixada para o ERB. Depois de pousar suavemente a pipeta de gravação no soma do neurônio a ser registrado, remova a pressão positiva e forme um gigaseal. Diminua a tensão de retenção para -70 mV. Aplique cuidadosamente pressão negativa para quebrar a configuração de toda a célula.
7. Mude para o grampo de corrente para monitorar e registrar o potencial de membrana em repouso. Sem ajuste para potenciais de junção líquida, o potencial de membrana em repouso estará entre -67 e -82 mV.
8. Execute uma gravação contínua de -70 mV por 4 a 5 minutos para detectar correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura (mEPSCs).
9. Analise 4 minutos de dados gravados para detecção de mEPSC usando o software de detecção de pico com as seguintes configurações: Limiar, 5; Período para busca de um máximo local, 10.000 μseg; Tempo antes de um pico para a linha de base, 5.000 μs; Período para pesquisar um tempo de decaimento, 20.000 μseg; Fração de pico para encontrar um tempo de decaimento, 0,37; Período para calcular a média de uma linha de base, 1.000 μs; Limiar de área, 20; Número de pontos para o pico médio, 1; Direção do pico, negativa.
10. Colete e salve informações sobre eventos detectados. Divida o número de eventos detectados em 4 min por 240 para determinar a frequência mEPSC em Hz.
11. Colete frequências mEPSC para 8 a 12 controles e 8 a 12 amostras tratadas com BoNT para cada condição de exposição. Analise a frequência em relação aos controles pareados por idade e lote. Determine a significância estatística da % de inibição da atividade sináptica usando ANOVA de uma via e teste post-hoc de Dunnett.

Resultados

Figura 1. Os ESNs adaptados à suspensão permanecem mitoticamente estáveis e expressam marcadores de pluripotência.(A) Esquema de manutenção e diferenciação do ESC. A presença ou ausência de ácido retinóico (AR) ou fator inibidor da leucemia (LIF) é marcada por um + ou –. Uma comparação entre dias in vitro (DIV) e estágios clássicos de desenvolvimento (DS) para culturas de ne...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tabela 1. ESC e ESN
Nocaute DMEM	Tecnologias da Vida	10829-018	Meios: Meio de cultura ESC
			Formulação e notas: 500 mL
100x MEM NEAA	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050	Suporte: armazenar a 4 °C por até 1 mês
			Formulação e notas: 6 mL
200 mM de L-alanil-L-glutamina	ATCC	30-2115	6 mL
ES qualificado FBS	Células-tronco aplicadas	ASM-5007	90 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	Rolamento A5955	3 mL
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologias da Vida	Rolamento 21985-023	1,1 mL
107 Unidades/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
Nocaute DMEM	Tecnologias da Vida	10829-018	Mídia: Meio de diferenciação ESC
			Formulação e notas: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Tecnologias da Vida	Rolamento 11140-050	Suporte: armazenar a 4 °C por até 1 mês
			Formulação e notas: 5 mL
200 mM de L-alanil-L-glutamina	ATCC	30-2115	5 ml
Soro qualificado pela ESC	Células-tronco aplicadas	ASM-5007	50 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	Rolamento A5955	2,5 ml
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologias da Vida	Rolamento 21985-023	0,9 mL
PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Meios: Meio de tripsinização NPC
			Formulação e notas: 100 mL
0,5 M EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Meio: congelar em 5 mL aliquote
			Formulação e notas: 0,266 mL
tripsina	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
Polietilenoimina (PEI)	Sigma-Aldrich	Pág. 3143	Mídia: Soluções de revestimento de superfície
			Formulação e notas: 2,5 μg/mL em H20
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	Pág. 7280	Mídia: use em 1 semana
			Formulação e notas: 100 μg/mL em H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/ml em H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Tecnologias da Vida	10565-018	Mídia: Meio de cultura NPC
			Formulação e notas: 492,5 mL
100x vitaminas N2	Tecnologias da Vida	17502-048	Suporte: armazenar a 4 °C por até 1 mês
			Formulação e notas: 5 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	Rolamento A5955	2,5 ml
Neurobasal A	Tecnologias da Vida	Rolamento 10888-022	Mídia: Meio de cultura ESN
			Formulação e notas: 482,5 mL
50x vitaminas B27	Tecnologias da Vida	Rolamento 17504-044	Mídia: armazenar a 4 °C por até 1 mês
			Formulação e notas: 10 mL
200 mM de L-alanil-L-glutamina	ATCC	30-2115	5 ml
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	Rolamento A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-desoxiuridina (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Meio: 2000x alíquota de inibidores mitóticos e armazenar a -20 °C
			Formulação e notas: dd 150 mg 5FDU e 350 mg uridina para 10 mL Neurobasal A. Filtro estéril, alíquota e congelamento. Use 2000x no meio de cultura ESN.
Uridina	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Tripsina	Tecnologias da Vida	12605-010	Mídia: Diversos
			Formulação e notas: armazenar na RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	loja na RT
Inibidor de tripsina de soja (IST)	Sigma-Aldrich	T6414	Conservar a -20 °C
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	loja na RT
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	Rolamento A4403	Prepare o estoque de 100 mM dissolvendo 100 mg de ácido ascórbico em 5,7 mL de mistura 50:50 DMSO / etanol.
Ácido retinóico (AR)	Sigma-Aldrich	R2625	Ressuspender 15 mg de AR em 9 ml de DMSO/etanol 50:50. Suplemento com 1 mL de estoque de ácido ascórbico 100 mM. Alíquota e conservada a -80 °C. Estável durante 6 meses.
Tabela 2. Névoa
NaCl	Sigma-Aldrich	Nº 71386	Mídia: Buffer de gravação extracelular
			Concentração Final (mM): 58,44
			MW: 140
Kcl	Sigma-Aldrich	Nº 60135	Meio: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
			Concentração Final (mM): 74,56
			MW: 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses.
			Concentração Final (mM): 119,98
			MW: 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	21115	Concentração Final (mM): 110,98
			MW: 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	Nº 63069	Concentração final (mM): 95,21
			MW: 1
D-glicose	Sigma-Aldrich	G8644	Concentração Final (mM): 180,16
			MW: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Concentração Final (mM): 238,3
			MW: 10
K-gluconato	Sigma-Aldrich	Pág. 1847	Mídia: Buffer de gravação intracelular
			Concentração final (mM): 234,5
			MW: 140
NaCl	Sigma-Aldrich	Nº 71386	Meio: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
			Concentração Final (mM): 58,44
			MW: 5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	Resposta A9187	Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses.
			Concentração final (mM): 507,18
			MW: 2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	G5884	Concentração Final (mM): 523,18
			MW: 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	21115	Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses.
			Concentração Final (mM): 110,98
			MW: 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	Nº 63069	Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses.
			Concentração final (mM): 95,21
			MW: 1
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses Concentração Final (mM): 380,35 MW: 1
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Meio: Estável a 4 °C por pelo menos 6 meses.
			Concentração Final (mM): 238,3
			MW: 10
Bicuculina	Tocris	131	Mídia: Diversos
			Concentração final (mM): 0,01
			MW: 417,85
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Concentração final (mM): 0,01
			MW: 276,12
Tetrodotoxina	Sigma-Aldrich	Rolamento A8001	Concentração final (mM): 0,005
			MW: 645,74
BoNT/A-/G	Metabiológicos	N/A	mídia:
			Concentração Final (mM): TBD
			MW: 150.000
Toxina tetânica	Sigma-Aldrich	T3194	Concentração Final (mM): TBD
			MW: 150.000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	Concentração final (mM): N/A
			MW: N/A
Tabela 3. Equipamentos e Software
MiniAnalysis (versão 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/A	Software de detecção de eventos
Igor Pro (versão 6.22A)	Métricas de onda	N/A	Software para visualização de gravações
Mestre de Retalhos	Heka	N/A	Software de aquisição de dados
Microscópio invertido Olympus IX51	Olimpo	N/A
Micromanipulador	Instrumento Sutter	MPC-365
Amplificador de fixação de remendo	Heka	ECB10USB
Extrator de micropipetas	Instrumento Sutter	P-1000
Tubos capilares de borossilicato	Instrumento Sutter	B150-86-10	Corning 7740
Lamínulas de vidro de 18 mm	pescador	12-545-84
Limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Filtro de células (40 μm)	pescador	08-771-1
Agitador de Dançarina do Ventre Stovall	pescador	Telefone: 15-453-211
Pratos de baixa aderência	pescador	05-539-101	Corning 3262
Pratos bacterianos	VWR	Rolamento 25384-302	100 x 15 milímetros