Produção e purificação de anticorpos recombinantes de células de mamíferos

Resumo

Fonte: Shivange, Gururaj, et al. Analisando a distribuição de tumor e tecido do anticorpo terapêutico específico do antígeno alvo. J. Vis. Exp.(2020).

O vídeo explica o processo de produção de anticorpos em células hospedeiras de mamíferos, desde a expressão gênica até a secreção. Envolve transcrição, tradução, reconhecimento de sinal, dobramento correto e eventual liberação no meio extracelular por meio de vesículas secretoras.

Protocolo

1. Expressão e purificação de anticorpos

1. Manutenção de células CHO
   1. Cultive células CHO em FreeStyle CHO Media suplementado com suplemento de glutamina 1x disponível comercialmente a 37 °C agitando a 130 rpm com 5% de CO₂ usando frascos Erlenmeyer delong, de vidro ou descartáveis.
      nota: É altamente recomendável usar um frasco defletor com tampa ventilada para aumentar a agitação e melhorar a transferência de gás durante as condições de agitação. O rendimento de anticorpos significativamente reduzido foi obtido com frascos regulares (não defletores) devido à agitação limitada da cultura em suspensão.
   2. Mantenha o número de células entre 1-5 x 10⁶ células/mL com >95% de viabilidade celular. Se o número de células aumentar mais de 5 x 10⁶ células/mL, divida as células. Nunca permita que as células CHO atinjam menos de 0,2 x 10⁶ células/mL.
2. Transfecção de células CHO
   1. Cultive células CHO em 200 mL de meio (2 x 10⁶ células/mL) em frascos defletores Erlenmeyer delongos.
      nota: As culturas em suspensão cultivadas em frascos defletores sempre produziram maiores rendimentos de proteína do que quando cultivadas em frascos não defletores.
   2. Em um tubo de 15 mL, pegue 5 mL de meio CHO FreeStyle e adicione 50 μg de DNA de clone VH e 75 μg de DNA de clone VL. Vórtice para misturar bem.
   3. Incubar a mistura de DNA em temperatura ambiente por 5 min.
      nota: A incubação mais longa reduz a produção de proteínas.
   4. Adicione 750 μL de estoque de polietilenoimina (PEI) de 1 mg / mL à solução de DNA e agite agressivamente a mistura por 30s. Incube em temperatura ambiente por mais 5 min.
      nota: O PEI deve ser feito fresco. O ciclo de congelamento e descongelamento múltiplo do PEI reduz significativamente o rendimento geral.
   5. Adicione toda a mistura de DNA e PEI às células enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente os frascos defletores de Erlenmeyer delongos, com células a 37 °C agitando a 130 rpm.
3. Expressão
   NOTA: O anticorpo possui um peptídeo sinal secretor projetado para sua extremidade N-terminal, que ajuda os anticorpos a serem secretados no meio.
   1. Cultive as células transfectadas a 37 ° C, com agitação a 130 rpm no Dia 1.
   2. No dia 2, adicione 2 mL de agente antiaglomerante 100x e 2 mL de solução antibacteriana-antimicótica 100x. Deslocar o balão para uma temperatura mais baixa (32-34 °C), com agitação a 130 rpm.
   3. A cada cinco dias, adicione 10 mL de ração Tryptone N1 e 2 mL de suplemento de glutamina 100x.
   4. Continue contando as células a cada três dias usando um hemocitômetro depois de corar uma alíquota de células com uma coloração azul de tripano. Certifique-se de que a viabilidade celular fique acima de 80%.
   5. No dia 10 ou 11, colha o meio para purificação de anticorpos. Centrifugar a cultura a 3000 x g, 4 °C durante 40-60 min e, em seguida, filtrar o meio transparente com filtros de garrafa de 0,22 μM.
4. Purificação
   nota: A purificação de anticorpos é realizada usando uma coluna de Proteína-A disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), usando uma bomba peristáltica.
   1. Equilibre a coluna com volume de duas colunas de tampão de ligação (20 mM de fosfato de sódio a pH 7,4).
   2. Passar o meio filtrado contendo o anticorpo (obtido na etapa 1.3.5) através da coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
   3. Lave a coluna com um volume de duas colunas de buffer de associação.
   4. Eluir o anticorpo em fracções de 500 μL utilizando 5 ml de tampão de eluição (30 mM de acetato de sódio a pH 3,4).
   5. Neutralize o pH do anticorpo eluído adicionando 10 μL de tampão de neutralização (acetato de sódio 3 M a pH 9) por fração.
      nota: Os números de fração 3-6 contêm a maior parte do anticorpo. É aconselhável manter todas as frações no caso de o anticorpo ser eluído numa fração posterior à esperada.
   6. Meça a concentração de anticorpos purificados usando um espectrofotômetro selecionando o protocolo padrão para IgG. A concentração final do anticorpo é obtida em mg/mL considerando o peso molecular e o coeficiente de absorção.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mídia FreeStyle CHO	Tecnologias Gibco Life	Gato # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Tecnologias Gibco Life	Gato # 15240-062
Agente antiaglomerante	Tecnologias Gibco Life	Cat # 01-0057DG
Seringa de insulina BD	BD Biociências	Gato #329420
Paquímetro IVIS Spectrum	PerkinElmer	Gato #124262
CHO CD EfficientFeed B	Tecnologias Gibco Life	Gato #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (meio de águia modificado de Dulbecco)	Corning	Gato # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Gato # 10-040-CV
IgG anti-humana conjugada Cy5 (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Gato # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Tecnologias Gibco Life	Gato # 35050-061
Kit HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	Gato # K21007
Coluna HiTrap MabSelect SuRe	GE Saúde	Gato # 11-0034-93
Isoflurano, USP	Covetrus	Gato # 11695-6777-2
Pomada lubrificante para os olhos	Atualizar Lacri-Lube	Gato #4089
Reagente de transfecção PEI	Thermo Fisher	Gato # BMS1003A
Modelos Experimentais: Linhagens Celulares
Humano: OVCAR-3	Coleção American Type Culture	ATCC HTB-161
Humano: células CHO-K	Estável transformado em nosso laboratório	ATCC CCL-61
Rato: 4T1	Gentil presente do Dr. Chip Landen, UVA
Rato: MC38	Gentil presente da Dra. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Autenticado por criação de perfil STR