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1. Expressão da hemaglutinina do vírus influenza via transfecção
- Células de rim embrionário humano em placa (HEK 293T) a uma densidade de 2 x 104 células/poço em uma cultura de tecidos brancos tratada com placa de 96 poços e deixe descansar por 4 h em uma incubadora a 37 ° C (com 5% de CO2).
- Células transfectadas com 100 ng de DNA codificador para hemaglutinina viral e 0,2 μL de reagente de transfecção por poço em um volume total de 50 μL.
nota: Tanto o plasmídeo quanto o reagente transfectante são diluídos em 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
- Depois de incubar as placas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 por 18 h, remova o meio de transfecção.
2. Avaliando a ativação mediada por FcRg/NFAT da atividade da luciferase por anticorpos monoclonais ou soros
- Primeiro, substitua o meio de crescimento das células transfectadas por 25 μL de meio de ensaio (1x RPMI 1640 suplementado com 4% (vol / vol) de soros bovinos fetais de baixa IgG).
- Em uma placa separada de 96 poços, execute diluições quádruplas dos anticorpos de interesse começando em 30 μg / mL usando o meio de ensaio. Realize diluições em triplicados e um exemplo de layout de placa é ilustrado na Figura 1A. Certifique-se de que um controle que exclua anticorpos (sem controle de anticorpos) e um controle de fundo (apenas tampão de ensaio) estejam incluídos.
nota: Para os controles "sem anticorpo" e de fundo, adicione 25 μL de tampão de ensaio em vez do anticorpo.
- Transfira 25 μL dos anticorpos diluídos em série da Etapa 2.2 para os poços correspondentes na placa de células transfectadas.
- Incubar a placa em uma incubadora a 37 °C (com 5% de CO2) por 15 min.
- Adicionar 25 μL da célula Jurkat efetora modificada apropriada que expressa FcgRIV murino ou FcgRIIIa humano (75.000 células/poço). O volume total para cada poço deve ser de 75 μL e a concentração final inicial do anticorpo é de 10 μg/mL (Figura 1B).
nota: Para o controle de fundo, adicione 25 μL de tampão de ensaio em vez de células efetoras. Para examinar a fagocitose mediada por células dependente de anticorpos, uma célula Jurkat modificada expressando o FcgRIIa humano pode ser usada.
- Incubar a placa numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante 6 h.
- Descongele e aqueça o tampão do substrato de luciferase em água a 37 °C por cerca de 1 h antes de usar.
nota: Para fazer o tampão do substrato de luciferase, reconstitua o substrato de ensaio de luciferase liofilizado no tampão de ensaio fornecido. O tampão de substrato reconstituído pode ser armazenado a -30 °C a -10 °C por até seis semanas.
- Adicione 75 μL / poço de tampão de substrato de luciferase a todos os poços, exceto para o controle de fundo.
- Leia em um luminômetro.
- Calcule a indução de dobra com a seguinte equação: Indução de dobra = (Valor induzido-Valor de fundo) / (Sem valor de mAb-Valor de fundo).
