NOTA: Os anticorpos específicos para HA que inibem a replicação viral geralmente podem ser categorizados em i) aqueles que se ligam ou adjacentes ao local de ligação do receptor no topo da cabeça globular e ii) aqueles que se ligam distal ao domínio de ligação ao receptor, que inclui o lado lateral da cabeça globular e a região do pedúnculo do HA. Os anticorpos que têm como alvo o local de ligação do receptor impedem o envolvimento de motivos de ácido siálico na superfície das células-alvo e podem ser medidos usando um ensaio de inibição da hemaglutinação (HI). Anticorpos HI-negativos, como anticorpos específicos do caule, ainda podem inibir a replicação viral, mas só podem ser avaliados usando ensaios de neutralização.
1. Categorização de anticorpos com base nas atividades de HI
- Ensaio HI
- Em uma placa de fundo em V de 96 poços, adicione 25 μL de 1x PBS nas colunas 2 a 12.
- Diluir o anticorpo monoclonal (mAb) 7B2 (específico da cabeça), 6F12 (específico do pedúnculo) e um controlo de isotipo para 100 μg/ml em 1x PBS e alíquota de 50 μL das preparações de anticorpos diluídos na coluna 1. Além disso, inclua um controle sem mAb adicionando 50 μL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) (Figura 1A).
- Realize diluições seriais de 2 vezes dos anticorpos transferindo 25 μL da coluna 1 para a coluna 2 e assim por diante. Descarte os últimos 25 μL da coluna 12 (Figura 1A).
nota: Certifique-se de incluir uma linha de controle sem anticorpos.
- Diluir o estoque de vírus (um vírus recombinante que expressa a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) de A/California/04/09 com os segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34) para 8 unidades de hemaglutinação/25 μL de estoque de vírus diluído. Adicionar 25 μL do estoque de vírus diluído (8 hemaglutinações) a cada alvéolo (linhas A a G).
nota: A mistura de anticorpos e vírus deve ter um volume final de 50 μL com uma concentração final inicial de 50 μg/mL.
- Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) durante 45 min.
- Para a linha de titulação reversa (H), adicione 50 μL de 1x PBS nos poços H2 a H12. Adicione 100 μL das 8 unidades de hemaglutinação/25 μL ao poço H1. Diluir em série duas vezes transferindo 50 μL de H1 para H2 e assim por diante. Rejeitar os últimos 50 μL do alvéolo H12. Finalmente, adicione 50 μL de glóbulos vermelhos de galinha a 0,5% (RBC) a todos os poços da placa de fundo em V de 96 poços.
nota: As amostras de mAb no ensaio devem ter um volume final de 100 μL: mAb (25 μL), vírus (25 μL) e hemácias (50 μL). O volume final do controle sem mAb deve conter 25 μL de 1x PBS, 25 μL de vírus e 50 μL de hemácias.
- Incubar a placa a 4 °C durante 1 h.
- Leia visualmente as placas para atividade HI. Se houver uma leitura positiva para um anticorpo específico, prossiga para a etapa 2.1 para gerar variantes de escape. Se o anticorpo for HI-negativo, prossiga abaixo para a etapa 1.2 para avaliar se o anticorpo tem atividade neutralizante em um ensaio de cultura de células.
nota: Uma leitura positiva de um mAb HI-ativo é indicada por um pellet vermelho escuro de hemácias no centro de um poço (Figura 1B; 7B2) que formará uma gota de lágrima quando a placa de fundo em V de 96 poços for mantida em um ângulo de 45 °. Uma leitura negativa não formará um grânulo vermelho escuro de hemácias no poço (Figura 1B; 6F12 e sem mAb). O controle do isotipo também não formará um pellet vermelho escuro de hemácias e deve ser idêntico ao anticorpo específico do caule, 6F12 ou à amostra de controle sem mAb (Figura 1B).
2. Geração de variantes mutantes de escape
NOTA: Os anticorpos neutralizantes que têm ou não atividade HI são analisados com os protocolos específicos descritos abaixo.
- Protocolo 1: Anticorpos HI-positivos/Neutralização positiva (Figura 2A)
- Prepare um estoque de vírus de 106 unidades formadoras de placa/mililitro (PFU/mL) em 1x PBS em um volume de 400 μL.
- Preparar quatro diluições do anticorpo de interesse em concentrações crescentes (por exemplo, 0, 0,5, 0,05 e 0,005 mg/mL) em 1x PBS em um volume de 100 μL por diluição.
NOTA: O vírus do tipo selvagem deve sempre ser transmitido em paralelo e na ausência de anticorpos. As sequências desses vírus passados ajudarão a distinguir entre adaptação às condições de cultura de células e mutações de escape.
- Misture 100 μL de 106 PFU/mL de vírus com 100 μL de cada diluição de anticorpo ou 100 μL de 1x PBS.
- Incubar durante 1 h numa incubadora a 37 °C (com 5% de CO2). Vórtice brevemente. Injete 200 μL de cada mistura em ovos de galinha embrionados livres de patógenos específicos (SPF).
- Incubar os ovos a 37 °C (sem CO2) durante 40-44 h.
- Sacrificar os ovos embrionados infectados pelo vírus incubando a 4 °C durante um mínimo de 6 h.
- Colha o fluido alantóide dos ovos, conforme descrito anteriormente.
- Realize o ensaio de hemaglutinação, conforme descrito acima. Se todas as preparações de fluido alantóide não tiverem títulos de hemaglutinação, repita a partir da etapa 2 com diluições de anticorpos variando de 0,005 mg / mL a 0,00005 mg / mL.
nota: Uma concentração de saturação de um anticorpo HI-positivo pode neutralizar todas as partículas virais presentes. Portanto, pode ser necessário diminuir a quantidade de anticorpo presente na passagem.
- Confirme as variantes de escape realizando o ensaio HI (etapa 1.1).
nota: Os anticorpos HI-ativos bloqueiam o envolvimento do HA de motivos de ácido siálico nas células-alvo. Portanto, um vírus na presença de seu anticorpo cognato perde a capacidade de aglutinar hemácias (presença de grânulo de hemácias). Teoricamente, as variantes de escape de anticorpos HI-ativos ainda podem se ligar a motivos de ácido siálico mesmo na presença de seu anticorpo cognato e, portanto, podem aglutinar hemácias (sem pastilha de hemácias). Se o HI do anticorpo de interesse ainda for detectável, repita o protocolo da etapa 2.1.2 com uma concentração inicial mais alta do anticorpo.
