Geração de anticorpos monoclonais recombinantes a partir de culturas de células de mamíferos

Resumo

Fonte: Nogales-Gadea, G. et al., Geração de anticorpos monoclonais IgG humanos recombinantes a partir de células B classificadas imortalizadas.J. Vis. Exp.(2015)

Este vídeo demonstra um método de geração de anticorpos a partir de células de mamíferos através da introdução de vetores plasmidiais com genes de cadeia pesada e leve. Esses vetores interagem com a polietilenimina e entram nas células formando poliplexos; Posteriormente, eles são traduzidos em proteínas individuais e montados em anticorpos completos, que são secretados no meio extracelular.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

1. Centrifugue 25 ml de sangue heparinizado dos participantes a 900 x g por 15 min, o mais rápido possível após a extração do sangue. Se houver menos sangue, reduza os reagentes de acordo. Execute todas as próximas etapas em um capô.
2. Transfira o soro para um tubo limpo. Ele pode ser usado em etapas posteriores para congelar PBMCs ou, no caso de pacientes autoimunes, para testar autoanticorpos.
3. Dilua o sangue com 10 ml de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 e ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo.
4. Adicionar 15 ml de uma solução contendo polissacarose e diatrizoato de sódio (1,077 g/ml) a um novo tubo de 50 ml.
5. Colocar suavemente o sangue sobre a solução no passo 1.4, aproximando as duas aberturas dos tubos até que os dois líquidos entrem em contacto muito lentamente e, em seguida, transvasar lentamente a suspensão de PBMC sobre o tubo de 50 ml. Esta etapa é fundamental para ter uma boa separação dos PBMCs.
6. Centrifugar o tubo obtido no passo 1.5 a 400 x g sem travão à temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
7. Após a centrifugação, recupere com a pipeta o anel branco que aparece na parte central do tubo, que contém os PBMCs.
8. Lave as células com 25 ml de mídia RPMI 1640.
9. Centrifugar 300 x g à RT durante 10 min.
10. Rejeitar o sobrenadante e lavar as células com 10 ml de RPMI 1640. Centrifugue novamente como na etapa 1.9.
11. Conte os PBMCs com uma câmara de Neubauer, conforme relatado anteriormente.
12. Processe os PBMCs como na seção 2 ou armazene-os para uso posterior da seguinte forma: 10 milhões de PBMCs para congelamento por tubo criogênico diluído em 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% e soro a 90% obtido na etapa 1.2. Congelar progressivamente e para armazenamento prolongado em nitrogênio líquido.

2. PBMCs de coloração para classificação de CD22+ e imunoglobulina G (IgG+) por citometria celular

1. Colocar os PBMCs num balão de cultura de² células de 25 cm com 6 ml de meio RPMI 1640 completo (suplementado com L-glutamina, tampão 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES), 50 U/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina e 10% de soro fetal bovino) e deixá-los recuperar O/N na incubadora a 37 °C a 5% de dióxido de carbono (CO₂).
2. Bloqueie os tubos estéreis de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com solução salina estéril tamponada com fosfato de albumina a 4% (PBS) durante a noite (O/N). Lave os tubos duas vezes com PBS e encha-os com 500 μl de meio RPMI 1640 completo. Use esses tubos para recuperar as células após a classificação.
3. Coletar os PBMCs em um tubo e centrifugar a 400 x g em RT por 5 min.
4. Ressuspenda as células no buffer de rotulagem (consulte as etapas 2.5 e 2.6) e conte-as. O tampão de marcação é soro bovino fetal estéril a 2% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM em PBS.
5. Prepare 3 tubos FACS com 10⁵ células cada e ressuspenda-os em 100 μl de tampão de marcação. Esses tubos servirão para definir as comportas da triagem.
   1. No primeiro tubo, adicione 5 μl de anticorpo anti CD22 PerCP (recomendado na ficha técnica do fabricante), no segundo tubo 20 μl de anti IgG PE (recomendado na ficha técnica do fabricante) e nada no terceiro tubo. Incubar no gelo e no escuro durante 30 min.
6. Ressuspenda 5 milhões de células em 200 μl de tampão de marcação em um tubo FACS e adicione 10 μl de anti CD22 PerCP e 40 μl de anti IgG PE. Incube as células no gelo e no escuro durante 30 min. Se a classificação de um número maior de células for desejada, aumente a escala de todos os reagentes.
7. Centrifugar células a 400 x g com freio baixo por 5 min em RT.
8. Decantar suavemente o sobrenadante.
9. Ressuspenda as células em 500 μl de tampão de marcação. Centrifugue as células a 400 x g com um freio baixo por 5 min em RT. Repita as etapas 2.7 e 2.8
10. Transvasar suavemente o sobrenadante e ressuspender as células em 300 μl de meio RPMI completo.
11. Passe as células por um filtro de 0,45 μm. As células estão prontas para serem classificadas.

3. Classificação das células B CD22+ e IgG+

1. Use 3 tubos de controle para estabelecer a viabilidade das células. No controle sem coloração, use o gráfico de dispersão direta e de tamanho para definir o gating de linfócitos. Os controles com o CD22 PerCP e o PE anti-IgG servem para estabelecer as comportas e a comporta de triagem. Execute os seguintes dados relatados anteriormente.
   NOTA: Uma porta é um conjunto de limites de valor (limites) que servem para isolar um grupo específico de eventos citométricos, no nosso caso, células, de um grande conjunto. No caso de uma porta de classificação, os limites de valor permitem a recuperação dos eventos citométricos, células, que estão dentro dos limites definidos: CD22+ e IgG+.
2. Como tubo de coleta na classificação, use os tubos bloqueados com 500 μl de meio RPMI 1640 completo, obtido na etapa 2.2.
3. Prossiga para classificar o duplo positivo: CD22+ IgG+. OBSERVE o número final de células em cada condição. Classifique as células em cima das células alimentadoras o mais rápido possível.

4. Irradiação de células alimentadoras

NOTA: Realize a preparação das células alimentadoras entre 1 - 3 dias antes da classificação. Pelo menos 5.000 células wi38 são necessárias por poço em uma placa de 96 poços redondos. Execute as etapas 4.1, 4.2 e 4.4 em um exaustor.

1. Cultive as células wi38 a 37 °C e 5% de CO₂ em meio RPMI 1640 completo (o mesmo que para PBMCs) até que o número desejado de células seja alcançado.
2. Irradie-os a 50 Grays, seguindo um protocolo descrito anteriormente. Realize a irradiação uma vez que as células wi38 tenham sido tripsinizadas e ressuspensas em meio RPMI completo, ou com wi38 conectado ao frasco de cultura e tripsinizado após a irradiação. Siga o método de tripsinização indicado pelo fornecedor das células wi38. Irradiar o número de células necessárias para cobrir os poços necessários para o plaqueamento de células B IgG+ (1% do PBMC total contado na etapa 1.11).
3. Placa de 90 μl contendo 5.000 células wi38 irradiadas em cada poço da placa de 96 poços redondos. Deixe os poços na linha externa da placa vazios (porque eles evaporam mais rápido) e use apenas os 60 poços no meio da placa para células de revestimento. Encha os poços externos que estão emoldurando a placa com 200 μl de PBS.
4. Coloque-os em uma incubadora a 37 ° C a 5% de CO₂, até que sejam necessários.

5. PBMCs classificados em placas, infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) e crescimento

1. Diluir os PBMCs classificados para colocar 50 células em 50 μl de meio completo RPMI 1640 por poço na placa de 96 poços redondos (previamente revestida com células irradiadas wi38). Execute as etapas em um exaustor equipado para o trabalho EBV.
   NOTA: a infecção de 50 células por poço é otimizada e aumenta a probabilidade de produzir um anticorpo monoclonal, no entanto, recomenda-se verificar isso por reação em cadeia da polimerase (PCR) conforme descrito anteriormente.
2. Adicione 60 μl de sobrenadante EBV (contendo 3 - 4 x 10⁸ cópias virais / ml) a cada poço na placa de 96 poços redondos. CUIDADO deve ser tomado durante o trabalho de EBV.
3. Adicionar 1 μg/ml de CpG (ODN2006) por alvéolo.
4. Deixe as células em uma incubadora a 37 ° C a 5% de CO₂.
5. Monitore visualmente o crescimento do clone ao microscópio após uma semana.
   NOTA: Alguns exemplos de crescimento de células B podem ser vistos abaixo na seção de resultados. Observe que as taxas de crescimento dos clones podem variar, e pode ser necessário um tempo extra para começar a ver alguma massa celular crescendo no meio do poço.
6. Após as^1ªs duas semanas, monitore o crescimento do clone ao microscópio óptico e prossiga para a primeira troca de meios. Pipetar lentamente 90 μl de meio da parte superior do poço e recolhê-los numa placa limpa de 96 poços. (As células B ficam no fundo do poço, então não há risco de aspirá-las).
   1. Adicionar a cada poço 100 μl de meio RPMI 1640 completo suplementado com 1 μg/ml de CpG (ODN2006) e 50 U/ml de IL2. Se os clones estiverem crescendo, analise esta primeira troca de meios por ensaio imunoenzimático (ELISA) como na etapa 6.
7. Monitore o crescimento do clone e mude o meio após a^3ª e a^4ª semana de crescimento novamente, tomando 90 μl de meio e adicionando 100 μl de meio RPMI 1640 completo suplementado com 1 μg / ml de CpG (ODN2006) e 50 U / ml de IL2. Use o sobrenadante coletado para monitorar a produção de IgG por ELISA como na etapa 6.
   NOTA: Após um mês, o crescimento do clone deve ser evidente pela observação de agregados de células redondas que geralmente ficam no meio do poço redondo do fundo.
8. Nesta etapa, altere a mídia da mesma forma que nas semanas anteriores, mas apenas com a mídia RPMI 1640 completa. Um bom indicador para saber o momento certo para mudar de mídia é a cor da mídia, se estiver ficando amarelada, as células precisam de uma troca de mídia.
9. Quando as placas de 96 poços contiverem clones grandes (aproximadamente 5 x 10⁵ células), transfira-as para um poço plano de uma placa de 24 poços. Adicione 300 μl de mídia RPMI 1640 completa ao novo poço. Ressuspenda o clone de crescimento de 96 poços, pipetando para cima e para baixo várias vezes, e transfira as células para o novo poço, distribuindo homogeneamente. Adicione novas mídias quando necessário.
   1. Quando os poços da placa de 24 poços estiverem cheios de células (aproximadamente 5 x 10⁶ células), transfira para um poço plano de uma placa de 6 poços. Adicione 2 ml de mídia RPMI 1640 completa ao novo poço. Ressuspenda as células na placa de 24 poços pipetando para cima e para baixo várias vezes e distribua-as homogeneamente no novo poço.
10. Adicione mídia quando necessário. Se as células não forem mantidas em cultura, pulverizar as células a 400 x g durante 5 min a RT. Armazenar os sobrenadantes para o teste ELISA. Lave o pellet de células uma vez com 1 x PBS, centrifugue novamente a 400 x g por 5 min e armazene seco a -80 ° C até a extração do RNA.
    1. Quando as células da placa de 6 poços se tornarem confluentes (aproximadamente 20 x 10⁶ células), transfira para uma placa de cultura de 60 mm. Adicione 4 ml de mídia RPMI 1640 completa à nova placa. Ressuspenda as células na placa de 6 poços e transfira-as conforme feito nas etapas 5.9 e 5.10.
11. Adicione novas mídias quando necessário. Nesta etapa, congele as células a 10 – 30 milhões/ml em 90% de soro fetal de bezerro e 10% de DMSO. Se forem necessárias quantidades maiores de células, continue a expansão dos clones em placas superficiais maiores.

6. ELISA para detecção de anticorpos IgG

1. Distribuir 50 μl/alvéolo numa placa ELISA de anticorpo F(ab)₂ Fc humano de cabra diluído a 1 200 em tampão de revestimento. O tampão de revestimento contém 50 mM de carbonato de sódio (Na₂, CO₃), pH 9,6.
2. Feche as placas com um adesivo de plástico e incube por 1 hora a 37 °C. Alternativamente, incube a 4 °C O/N.
3. Lave cada poço 6 vezes com 200 μl de tampão de lavagem. O tampão de lavagem contém 0,05% de Tween-20 em 1 x PBS. Não toque ou arranhe a superfície do poço onde o anticorpo se ligou.
4. Bloco com tampão de bloqueio, 100 μl/poço. O tampão de bloqueio contém 4% de leite em pó desnatado no PBS. Feche a placa e incube 1 hora a 37 °C.
5. Não lave. Descarte o tampão de bloqueio e bata o prato 3 vezes de cabeça para baixo em uma toalha de papel para remover o líquido residual.
6. Incubar sobrenadantes e padrões de clones.
   1. Para um primeiro teste, diluir os sobrenadantes dos clones obtidos na etapa 5.6 ou 5.7 1/3 em RPMI. Para os padrões, dilua com solução de IgG humana média RPMI para obter: 1.000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml e branco. Utilizar 50 μl/alvéolo e incubar a 37 °C durante 60 min. Analise diluições adicionais do sobrenadante do clone para testar a afinidade do anticorpo, como 1/10 ou 1/100.
7. Lave conforme feito na etapa 6.3.
8. Use 50 μl / poço de cabra F (ab) 2 anti-humano IgG Fc peroxidase conjugada diluída 1:20.000 no tampão de incubação. O tampão de incubação contém 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,02% de Tween 20 em 1x PBS. Incubar a 37 °C durante 60 min.
9. Lave conforme feito na etapa 6.3.
10. Adicionar 100 μl/solução de substrato de poço contendo 0,1% de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB). Incube por 10 min até que uma cor azul estável se forme nos poços. Tenha cuidado; Não espere muito!
11. Pare a reação adicionando 50 μl de ácido sulfúrico 2 M (H₂SO₄). Meça a absorção a 450 nm, dentro de 30 minutos após a interrupção da reação.
    NOTA: Todos os sobrenadantes dos clones com 3 desvios padrão sobre o branco serão considerados positivos para anticorpos humanos IgG. Para confirmação dos clones positivos, este ELISA deve ser repetido pelo menos três vezes em diferentes sobrenadantes do mesmo clone. Também para descartar a possibilidade de reatividade cruzada inespecífica é recomendado para garantir que não haja sinal quando os sobrenadantes são incubados em poços não revestidos, mas bloqueados. Nesta etapa, um ensaio de detecção para rastrear a especificidade antigênica dos anticorpos de interesse pode ser realizado antes de prosseguir para a seção 7.

7. Isolamento de RNA e Síntese de DNA complementar de primeira fita (cDNA) dos clones IgG produtores

1. Assim que a produção de IgG for confirmada por ELISA, extraia o RNA do clone.
2. Para extrair RNA de células que crescem nas etapas 5.7 ou 5.9, use o kit de síntese direta de cDNA de células III sobrescrito, que permite a obtenção de DNA de 10.000 células para uma célula.
3. Para extrair RNA de grandes quantidades de células ou do pellet armazenado na etapa 5.11, use o kit de isolamento de RNA de alta pureza. Outros sistemas de extração de RNA também podem ser adequados nesta etapa. Siga as instruções do fabricante.
4. Para números de células entre 1 x 10⁶ e 1 x 10⁴ use o sistema de transcrição reversa, seguindo as instruções do fabricante. Outros sistemas para síntese de cDNA de primeira fita também podem ser usados.

8.^1ª e^2ª PCR para amplificação das cadeias pesadas e leves dos clones de células B produtoras de IgG

1. Com o cDNA dos clones celulares, obtido nas etapas 5.6 e 5.7 e positivo no ELISA IgG na etapa 6, realizar PCR com os primers listados na Tabela 1.
2. Configure PCRs independentes para cada cadeia IgG pesada, kappa e lambda. Faça uma solução estoque com primers diretos e reversos em concentrações iguais. Adicione-os à reação na concentração final de 0,4 μM.
3. Use 1 μl da síntese de cDNA para realizar a 1^ST PCR. Aqui, execute reações de 20 μl usando as instruções do fabricante Takara Taq. Como alternativa, use outras polimerases.
4. Colocar a^1ª PCR nas seguintes condições de ciclo: 94 °C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 °C por 30 seg; 58 °C por 30 seg; 72 °C por 45 seg; 72 °C por 7 min; deixe esfriar a 4 °C. Inclua um branco na reação, para detectar possíveis contaminações.
5. Prepare 1x TBE (89 mM Tris-borato e 2 mM EDTA). Em um volume de 100 ml de 1x TBE, adicione 1 g de agarose (gel de agarose a 1%). Aqueça a solução no micro-ondas por aproximadamente 1 min, até que a agarose se dissolva. Em seguida, adicionar 4 μl de brometo de etídio a 10 mg/ml (ou corante de ADN equivalente) e homogeneizar.
   1. Despeje o conteúdo em uma bandeja e espere até polimerizar. Execute 5 μl da mistura de PCR no gel para visualizar as bandas. Os fragmentos da cadeia pesada devem estar em torno de 400 - 550 bp, enquanto a cadeia leve deve estar em torno de 300 - 400 bp. Se as bandas não forem detectadas, prossiga da mesma forma para a^2ª PCR.
6. Use 1 μl da primeira mistura de PCR para realizar a^2ª PCR. Use os mesmos reagentes da etapa 8.2, mas usando a mistura adequada de primers (consulte a Tabela 1). Para a^2ª PCR, use as seguintes condições: 94 °C por 5 min; (50 ciclos de: 94 °C por 30 seg; 56,5 °C por 30 seg e 72 °C por 55 seg); 72 °C por 7 min; deixar arrefecer a 4 °C. Incluir um branco na reacção, para detectar possíveis contaminações por PCR.
7. Preparar um gel de agarose como descrito no ponto 8.5. Execute o gel para visualizar o produto de PCR como em 8.5.1 Use as amplificações que contêm os fragmentos de tamanho certo para clonagem na etapa 9 e produza os anticorpos na etapa 10.
8. Sequencie o DNA, usando 10 μl de reação contendo: 100 ng da^2ª PCR, 0,2 μM do primer ou mistura de primer, 1 μl do terminador e 1 μl do tampão. Realizar a reação de sequenciação nas seguintes condições: (25 ciclos de: 96 °C durante 10 segundos; 50 °C durante 5 segundos; e a 60 °C durante 4 min); 60 °C por 7 min; deixe arrefecer a 4 °C.
9. Purifique as reações de sequenciamento com colunas microspin G50 seguindo as instruções do fabricante. Avalie as sequências da ligação em um analisador de sequência automático, conforme descrito anteriormente. Os eletroferogramas devem estar limpos e corresponder a uma única sequência de imunoglobulina.
   NOTA: Se os produtos de PCR mostrarem sequências de imunoglobulinas pouco claras ou mistas, considere cloná-las usando o sistema TopoTA, para obter sequências isoladas e, em seguida, prossiga para a etapa 9.

9. Clonagem e Sequenciamento das Cadeias Pesadas e Leves dos Clones IgG Produtores

1. Preparar 1 μg de ADN dos vectores pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 e pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Digerir estes vectores com as enzimas de restrição adequadas. Use EcoRI e BsiWI para pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI e AvrII para pFUSE2ss-CLIg-hl2 e EcoRI e NheI para pFUSEss-CHIg-hG1. Use 3 unidades de cada enzima de restrição para 1 μg de DNA do vetor.
   1. Digerir com uma enzima e purificar o produto digerido com um Kit de Purificação PCR. Digerir com a segunda enzima e purificar com um Kit de Extração em Gel (de acordo com o protocolo do fabricante). Corte o fragmento de interesse do gel de agarose. Prepare o gel de agarose como na etapa 8.5.
3. Digerir os^2º produtos de PCR do clone IgG produtor: EcoRI e BsiWI para amplificação da cadeia kappa, EcoRI e AvrII para amplificação da cadeia lambda e EcoRI e NheI para amplificação da cadeia pesada. Digerir com uma enzima e purificar o produto digerido com um Kit de Purificação PCR. Digerir com a segunda enzima e purificar o produto digerido com um Kit de Purificação por PCR. Use as mesmas unidades de enzimas e quantidade de DNA da etapa 9.2.
4. Ligue os fragmentos de PCR dentro dos vetores com T4 DNA ligase 16 °C O/N seguindo as recomendações do fabricante. A proporção usada deve ser de 1 : 2 (vetor: inserir).
5. Use 1 μl da ligação para transformar bactérias DH5α. Siga as condições do fabricante DH5α para transformação. Espalhe bactérias em placas de blasticidina ou zeocina, dependendo do tipo de vetor usado. Incubar as placas O/N a 37 °C.
6. Cultive colônias únicas e extraia DNA com um kit de minipreparação, seguindo as instruções do fabricante. Use para cultivo de colônia única e extração de DNA do fabricante, recomendações do kit de minipreparação de DNA. Analise-os por digestão com as enzimas usadas para preparar vetores e inserções como nas etapas 9.2 e 9.3.
7. Sequenciar o ADN, utilizando 100 ng do vetor, tal como feito nos passos 8.8 e 8.9.

10. Produção de anticorpos em células HEK

1. Cultive células HEK no Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, 1% de L-glicose, 1% de penicilina/estreptavidina (DMEM+) até uma confluência de 75% em uma placa de cultura de células de 150 mm. Execute em um capô as etapas 10.1 a 10.7.
2. Antes da transfecção, troque o meio por meio como antes, mas sem soro fetal de bezerro.
3. Para cada transfecção de cadeia leve e pesada, prepare uma mistura de transfecção com 2,5 ml de DMEM (sem soro), 9 μg do vetor com a cadeia pesada, 6 μg do vetor com a cadeia leve e 100 μl de solução de polietilenonimina (PEI) (de um estoque de 1 μg / μl). Incubar em RT por 15 min.
4. Adicione suavemente 2,5 ml da mistura de transfecção preparada na etapa 10.3 às células HEK na placa. Balance o prato para distribuir de forma homogênea.
5. Incubar as células na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 horas.
6. Troque o meio de cultura por meio sem soro fetal de bezerro.
7. Colete o meio das placas 4 dias depois.
   NOTA: Os anticorpos no meio podem ser usados para caracterizar sua reatividade in vitro e in vivo.

Tabela 1. Primers usados.

1st primers de PCR
	Atacante (5'-3')	Reverso (3'-5')
IgG	5 ′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5 ′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
	5 ′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd primers de PCR
	Atacante (5'-3')	Reverso (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 a 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG CONTA
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3 ′ BsiWI Jκ 1 a 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3 ′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 a 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 a 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 a 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	Rolamento 10771	Solução contendo polissacarose e diatrizoato de sódio
Classificador de células FACSAria II	BD Biociências
96 placas de micropoços com fundo em U	Costar	3799
Instituto Memorial Avançado de Roswell Park (RPMI) 1640 médio	Gibco, Tecnologias de Vida	12633-020
30% v/v de sobrenadante contendo EBV da linhagem celular B95-8	ATCC	CRL-1612	3,4 x 108 cópias/ml
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Células Wi38	Sigma-Aldrich	90020107
Interleucina-2	Roche	10799068001
Placas ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
Fragmento AffiniPure F(ab')2 IgG anti-humano de cabra, fragmento específico de Fcγ (não conjugado)	Jackson ImmunoResearch	109-006-008
4% de leite em pó desnatado (bloqueador de grau Blotting)	Biorad	170-6404
IgG humana	sigma	I 2511	Imunoglobulina purificada por IgG HUMANA, 5,6 mg/ml
IgG Fcγ anti-humana F(ab)2 caprina (conjugada com peroxidase (PO))	Jackson ImmunoResearch	109-036-008
Leitor ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
AffiniPure Rabbit IgM Anti-Human conjugado com peroxidase, Fc5μ	Jackson ImmunoResearch	309-035-095
Sistema de síntese direta de cDNA de células SuperScript III	Invitrogen	18080-200
Sistema de PCR GeneAm 2700 da Applied Biosystems (ABI)	Biossistemas Aplicados
Kit de isolamento de RNA de alta pureza	Roche	11828665001
Kit de sistema de transcrição reversa	Promega	Rolamento A3500
Taq DNA Polimerase Recombinante	Takara	R001A
Primers (2μl)	sigma
Agarose ultrapura	Invitrogen	16500-500
Escada de 100 bp	Invitrogen	Rolamento 15628-019
Quantidade Um 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
Kit de purificação de PCR QIAquick	QIAGEN	Rolamento 28106
Kit de sequenciamento de ciclo BigDye Terminator v3.1	Biossistemas Aplicados	4337455
Placa de reação de 0,1 ml (MicroAMP Optical de 96 poços)	Biossistemas Aplicados	4346906
Analisador genético ABI300	Biossistemas Aplicados	4346906
Células competentes para DH5α (E. coli)	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 pb)	Invivogen	pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 pb)	Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 pb)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 pb)	Invivogen	PFUSE2SS-HCLL2
SOC médio	Invitrogen	15544-034
Meio de ágar à base de LB suplementado com Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	FAS-ZN-S
Meio líquido à base de caldo fantástico (TB) suplementado com zeocina (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	FAS-ZN-L
Kit DNA Miniprep	Omega Bio Tecnologia	D6942-02
Nanodrop (espectrofotômetro ND1000)	Nanodrop
Meio de ágar à base de LB suplementado com Blasticidina (Ágar Explosão de Mídia Rápida)	Invivogen	FAS-BL-S
Meio líquido à base de caldo fantástico (TB) suplementado com blasticidina (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	Biolabs da Nova Inglaterra	R0101S	20.000 U/ml, em 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Biolabs da Nova Inglaterra	R0131S	10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 2.1
Escada de DNA de 2 Log	Biolabs da Nova Inglaterra	N3200S	0,1-10,0 kb, 1.000 μg/ml
XmaI	Biolabs da Nova Inglaterra	R0180S	10.000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer
BsiWI	Biolabs da Nova Inglaterra	R0553S	10.000 U/ml, em 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Biolabs da Nova Inglaterra	R0174S	5.000 U/ml, em 10x CutSmart Buffer
Fosfatase alcalina termossensível FastAP	Thermo Científico	EF0651	1 U/μL, em buffer FastAP 10x
Células competentes DH5α	Invitrogen	18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, clone: HIB22	Fisher científico	BDB563942
Kit Miniprep QIAprep Spin	QIAGEN	27106
Exterminador do Futuro BigDye v3.1	Biossistemas Aplicados	4337455