Uma tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra uma metalopeptidase

Resumo

Fonte: Xia, P., et al. Produção de anticorpos monoclonais direcionados à aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio para produzir anticorpos monoclonais contra a aminopeptidase suína N (APN), uma metalopeptidase ligada à membrana, usando uma tecnologia tradicional de hibridoma. Ao imunizar um camundongo com APN, as células do baço são colhidas e fundidas com células de mieloma imortais para produzir hibridomas. Os hibridomas são então selecionados e proliferados usando o meio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) para produzir anticorpos monoclonais específicos para diferentes epítopos de APN.

Protocolo

Todos os procedimentos de modelo animal foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Imunização animal

1. Subcutâneo (s.c) injeta camundongos BALB/c fêmeas, 6-8 semanas de idade, com 50 μg de proteína APN ou solução salina tamponada com fosfato (PBS, controle negativo) misturada com adjuvantes uma vez a cada 2 semanas. Use o adjuvante de Freund completo que contém as micobactérias mortas pelo calor para a imunização inicial e o adjuvante de Freund incompleto para imunizações de reforço. Misture volumes iguais de proteína APN (ou PBS) e adjuvante de Freund ou adjuvante de Freund incompleto, respectivamente.
2. Detectar títulos de anticorpos contra APN no soro desses camundongos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) usando uma placa de microtitulação revestida com 5 μg / mL de proteína APN diluída em 0,05 M PBS (pH 9,6).

2. Tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra APN

1. Injete intraperitonealmente (i.p.) 100 μg de proteína APN nos camundongos selecionados para um reforço final do antígeno.
2. Três dias depois, eutanasiar os camundongos usando pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) e luxação cervical.
3. Colete os baços e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura. Filtre a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 mesh para remover os detritos do tecido e colha as células do baço usando centrifugação (1500 × g, 10 min) para remover a membrana do baço.
4. Semeie células SP2/0 de mieloma de camundongo em um frasco de 25 cm² contendo 5 mL de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 6% de soro fetal bovino (FBS) e cultura a 37 ° C, 6% de atmosfera de CO₂ para manter a viabilidade celular. Após 5-6 dias de cultivo, as células atingem 80%-90% de confluência pós-ressuscitação e estão na fase de log de crescimento. Sob o microscópio, as células são redondas, brilhantes e claras.
5. Um dia antes da hibridização, colete macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos de acordo com um método publicado anteriormente.
6. Semeie macrófagos peritoneais a uma densidade de 0,1-0,2 × 10⁵ / mL em placas de 96 poços, cada poço contendo 100 μL de meio HAT (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1x suplemento de HAT) e incube a 37 ° C, 6% de CO₂ atmosfera umidificada durante a noite.
7. Para hibridização, aspire suavemente as células SP2/0 com uma pipeta de 8 a 10 frascos e suspenda em 10 mL de meio DMEM sem soro. Lave as células com DMEM fresco, centrifugue (1500 × g, 10 min) duas vezes e, em seguida, ressuspenda em 10 mL de DMEM.
8. Misture as células do baço quantificadas com células SP2/0 na proporção de 10:1 e transfira para tubos de 50 mL. Centrifugar (1500 × g, 10 min) e rejeitar o sobrenadante. Colete os pellets de células na parte inferior dos tubos e bata com a palma da mão para soltar os pellets antes da hibridização.
9. Adicione 1 mL de polietilenoglicol 1500 (PEG 1500), pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota usando um conta-gotas ao pellet de célula solta durante o período de 45 s, girando suavemente o fundo do tubo.
10. Adicione lentamente 1 mL de DMEM pré-aquecido a 37 ° C à mistura acima durante o período de 90 s, seguido por mais 30 mL de DMEM fresco. Coloque o tubo de fusão em banho-maria a 37 °C por 30 min.
11. Após a incubação no banho quente, colher as células e ressuspender em meio HAT. Em seguida, cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais.
12. Cinco dias depois, adicione 100 μL de meio HAT fresco a cada poço e incube a placa por mais 5 dias, após os quais substitua o meio por meio HT (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1x suplemento HT).
13. Use uma placa de microtitulação revestida com 5 μg / mL de proteína APN diluída em 0,05 M PBS (pH 9,6) para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante do hibridoma usando o ensaio ELISA.
    1. Quando o meio nos poços da placa de 96 poços fica amarelo (devido ao crescimento celular e liberação de metabólitos, o pH no meio diminui para 6,8 e o vermelho de fenol muda de fúcsia para amarelo) ou aglomerados de células são observados, adquira 100 μL de sobrenadante dos poços selecionados e adicione aos poços da placa ELISA revestida. Use um leitor de microplacas para medir os valores de OD₄₅₀.
    2. Use os anticorpos policlonais contra APN e soro de camundongo não infectado como controle positivo e negativo, respectivamente, e use PBS como controle em branco. Neste estudo, a razão OD₄₅₀ da amostra para o controle negativo (P/N) ≥ 2,1 foi reconhecida como padrão de seleção positiva.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Complete o adjuvante de Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Imunização animal
DMEM	Gibco	11965092	Cultura de células
DMEM-F12	Gibco	12634010	Cultura de células
Kit de Contagem de Células Melhorado-8	Beyotime Biotecnologia	C0042	Medição da viabilidade e vitalidade celular
Soro fetal bovino	Gibco	Rolamento 10091	Cultura de células
Antibiótico Seletivo Geneticina™	Gibco	11811098	Antibiótico seletivo
Suplemento HAT (50X)	Gibco	21060017	Seleção de células
Suplemento HT (100X)	Gibco	11067030	Seleção de células
Adjuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Imunização animal
Leitor de microplacas	BioTek	CAIXA 998	Análise ELISA
Polietilenoglicol 1500	Roche Diagnósticos	10783641001	Fusão celular
Microplaca de 96 poços	Corning	3599	Cultura de células