1. Preparação do antigénio da proteína N aminopeptidase suína (APN)
NOTA: A cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e as células APN expressas de forma estável pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 foram construídas em um estudo anterior.
- Recupere bactérias de um estoque de glicerol congelado e coloque em placas Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg / mL de canamicina (Km +) para isolamento de colônia única.
- Selecione uma única colônia da placa recém-listrada, cultive em 4 mL de meio LB (10 g / L de triptona, 10 g / L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g / L de extrato de levedura, pH 7,2) suplementado com Km + (50 μg / mL) e deixe crescer durante a noite (12-16 h) com agitação (178 rpm) a 37 ° C.
- Diluir as bactérias preparadas a 1:100 em caldo fresco Km+ LB e incubar a 37 °C agitando durante 2-3 h até que o OD600 atinja 0,4-0,6.
- Adicionar β-d-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) ao meio até uma concentração final de 0,4 mM e incubar as culturas durante mais 10 h a 16 °C.
- Consequentemente, centrifugue e colha as bactérias usando indução IPTG (10.000 × g, 4 ° C 15 min).
- Ressuspenda o pellet celular usando 5 mL de tampão LEW (Lise / Equilíbrio / Lavagem) (50 mM de fosfato de sódio anidro monobásico (NaH2PO4) e 300 mM de NaCl, pH 8,0) contendo 1 mg / mL de lisozima. Agitar a suspensão bacteriana durante 30 min em gelo e sonicar completamente (15 s de pulso e 20 s desligado, 15 min) utilizando um homogeneizador ultrassónico.
- Centrifugar o lisado bruto de células a 4 °C e 10.000 × g durante 30 minutos para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para uma coluna pré-equilibrada e incube 1-2 min antes da drenagem por gravidade. Repita esta etapa três vezes.
- Lave a coluna com 20 mL de tampão LEW e escorra por gravidade. Eluir a proteína APN marcada com histidina usando 9 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM imidazol, pH 8,0) e coletar em tubo de diálise.
- Dialisar a solução proteica durante a noite a 4 °C em tampão carbonato de sódio-bicarbonato de sódio (solução salina tamponada com fosfato (PBS), NaCl 135 mM, cloreto de potássio 4,7 mM,NaH 2PO4 2 mM e fosfato de sódio dodecahidratado dibásico 10 mM, pH 7,2).
- Analise usando um gel SDS-PAGE a 12,0% e western blotting para avaliar a pureza da proteína APN.
- Carregar 5 μg de proteína em cada poço do gel e deixar funcionar a 110 V durante 1,5 h. Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por 50 min a 15 V. Determine a concentração da proteína purificada usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
2. Imunização animal
- Por via subcutânea (s.c) injetam camundongos BALB/c fêmeas, de 6 a 8 semanas de idade, com 50 μg de proteína APN ou PBS (controle negativo) misturados com adjuvantes uma vez a cada 2 semanas. Use o adjuvante de Freund completo que contém as micobactérias mortas pelo calor para a imunização inicial e o adjuvante de Freund incompleto para imunizações de reforço. Misture volumes iguais de proteína APN (ou PBS) e adjuvante de Freund ou adjuvante de Freund incompleto, respectivamente.
- Detectar títulos de anticorpos contra APN no soro desses camundongos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) usando uma placa de microtitulação revestida com 5 μg / mL de proteína APN diluída em 0,05 M PBS (pH 9,6).
3. Tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra APN
- Injete intraperitonealmente (i.p.) 100 μg de proteína APN nos camundongos selecionados para um reforço final do antígeno.
- Três dias depois, eutanasiar os camundongos usando pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) e luxação cervical.
- Colete os baços e lave com o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco duas vezes para remover o sangue e as células de gordura. Filtre a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 mesh para remover os detritos do tecido e colha as células do baço usando centrifugação (1500 × g, 10 min) para remover a membrana do baço.
- Semeie células SP2/0 de mieloma de camundongo em um frasco de 25 cm2 contendo 5 mL de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino (FBS) e cultura a 37 °C, 6% de dióxido de carbono (CO2) atmosfera para manter a viabilidade celular. Após 5-6 dias de cultivo, as células atingem 80%-90% de confluência pós-ressuscitação e estão na fase de log de crescimento. Sob o microscópio, as células são redondas, brilhantes e claras.
- Um dia antes da hibridização, colete macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos de acordo com um método publicado anteriormente.
- Semeie macrófagos peritoneais a uma densidade de 0,1-0,2 × 105 / mL em placas de 96 poços, cada poço contendo 100 μL de meio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1x suplemento de HAT) e incube a 37 ° C, 6% de atmosfera umidificada de CO2 durante a noite.
- Para hibridização, aspire suavemente as células SP2/0 com uma pipeta de 8 a 10 frascos e suspenda em 10 mL de meio DMEM sem soro. Lave as células com DMEM fresco, centrifugue (1500 × g, 10 min) duas vezes e, em seguida, ressuspenda em 10 mL de DMEM.
- Misture as células do baço quantificadas com células SP2/0 na proporção de 10:1 e transfira para tubos de 50 mL. Centrifugar (1500 × g, 10 min) e rejeitar o sobrenadante. Colete os pellets de células na parte inferior dos tubos e bata com a palma da mão para soltar os pellets antes da hibridização.
- Adicione 1 mL de polietilenoglicol 1500 (PEG 1500), pré-aquecido a 37 ° C, gota a gota usando um conta-gotas ao pellet de célula solta durante o período de 45 s, girando suavemente o fundo do tubo.
- Adicione lentamente 1 mL de DMEM pré-aquecido a 37 ° C à mistura acima durante o período de 90 s, seguido por mais 30 mL de DMEM fresco. Coloque o tubo de fusão em banho-maria a 37 °C por 30 min.
- Após a incubação no banho quente, colher as células e ressuspender em meio HAT. Em seguida, cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais.
- Cinco dias depois, adicione 100 μL de meio HAT fresco a cada poço e incube a placa por mais 5 dias, após os quais substitua o meio por meio HT (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1x suplemento HT).
- Use uma placa de microtitulação revestida com 5 μg / mL de proteína APN diluída em 0,05 M PBS (pH 9,6) para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante do hibridoma usando o ensaio ELISA.
- Quando o meio nos poços da placa de 96 poços fica amarelo (devido ao crescimento celular e liberação de metabólitos, o pH no meio diminui para 6,8 e o vermelho de fenol muda de fúcsia para amarelo) ou aglomerados de células são observados, adquira 100 μL de sobrenadante dos poços selecionados e adicione aos poços da placa ELISA revestida. Use um leitor de microplacas para medir os valores de densidade óptica 450 (OD450).
- Use os anticorpos policlonais contra APN e soro de camundongo não infectado como controle positivo e negativo, respectivamente, e use PBS como controle em branco. Neste estudo, a razão OD450 da amostra para o controle negativo (P/R) ≥ 2,1 foi reconhecida como padrão de seleção positiva.
- Após três rodadas consecutivas de seleção positiva, selecione o hibridoma que mostra resposta sorológica aumentada contra a proteína APN para um ensaio de diluição limitado.
- Prepare macrófagos peritoneais e semeie em placas de 96 poços, conforme descrito anteriormente.
- Suspenda as células do hibridoma em meio HT a uma média de 0,5-2 células por poço e cultive em uma incubadora de CO2 a 37 ° C, 6%. Repita esta etapa três ou quatro vezes até que a taxa positiva indicada pelo imunoensaio ELISA atinja 100%.
- Sob a pressão de congelamento e descongelamento contínuos, selecione as células de hibridoma positivas capazes de secretar anticorpos anti-APN de forma estável e proliferar normalmente.
- Administre uma única injeção intravenosa de 0,3 mL de pristane em cada camundongo (8-10 semanas). Aos 10 dias após receber o pristine, injete em cada camundongo 2-5 x 105 células de hibridoma em 0,5 mL de PBS (pH 7,2).
- Colete cuidadosamente o fluido peritoneal da cavidade peritoneal desses camundongos 8 a 10 dias após a injeção.
- Colha os sobrenadantes por centrifugação a 5.000 × g por 15 min e purifique os anticorpos nos sobrenadantes usando sulfato de amônio saturado a 33% [(NH4)2SO4] precipitação e agarose proteína A.
4. Caracterização de anticorpos monoclonais (mAbs) contra a proteína APN
- Determine o subtipo de imunoglobulina dos mAbs coletados usando um SBA Clonotyping System-HRP. Use SDS-PAGE e western blotting para avaliar a pureza e a especificidade do mAb.
- Analise a especificidade do epítopo de mAb em relação à proteína APN usando ELISA. O valor de aditividade (AV) é a razão entremAbs OD (a+b) e (mAbs-a+ODmAbs-b), que é usada para avaliar se os mAbs reconhecem o mesmo sítio antigênico; ODmAbs-a e ODmAbs-b representam os valores de OD450 de diferentes anticorpos monoclonais contra APN sozinho, e ODmAbs (a+b) representam os valores de OD450 de uma mistura 1:1 de dois mAbs contra APN.
- Avaliar cada amostra em pelo menos quatro réplicas e repetir toda a experiência pelo menos três vezes.
5. Expressão de rAbs em APN
- Extraia o RNA total das células e baços de hibridoma mencionados acima de camundongos imunizados com APN (por exemplo, TRIzol). Sintetize DNA complementar (cDNA) usando um kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
- Amplificar regiões variáveis de mAbs usando reação em cadeia da polimerase (PCR) aninhada e determinar sequências de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) usando sequenciamento. Analise os genes que codificam VH e VL usando a ferramenta de análise do genoma do camundongo IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combine os genes VH e VL com sequências líderes e subclone-os sequencialmente nos vetores pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, usando tecnologia de clonagem contínua para permitir a inserção de fragmentos de DNA sem cicatrizes. Os primers específicos estão listados na Tabela 1.
- Cultive as bactérias transformadas em pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 na presença de 0,4 mM IPTG em agitadores orbitais a 37 °C por 10 h. Em seguida, induza, purifique e avalie a expressão da proteína rAbs usando purificação de proteína de rotina.
- Semear 100 μL 0,5 x 105 células CHO por poço em uma placa de 96 poços e incubar a 37 ° C em uma atmosfera de 6% de CO2 por 18-24 h. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, dilua o plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN com Opti-MEM até uma concentração final de 0,1 μg/μL e incube 5 min em temperatura ambiente antes de usar para transfecção.
- Misture suavemente 50 μL de plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluído com 1 μL de Lipofectamine 2000 e 49 μL de Opti-MEM e incube a mistura por mais 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO e incube a 37 ° C em atmosfera de CO6% 2 por 4-6 h.
- Às 4-6 h pós-transfecção, substitua o meio por meio DMEM-F12 suplementado com 10% de FBS e incube a placa por mais 48 h. Em seguida, adicione 400 μg/mL G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.
- Após 10 dias de seleção usando meio DMEM-F12 suplementado com 10% de FBS e 400 μg / mL G418, classifique as células (3,0 × 107 células / mL) por classificação de células ativadas por fluorescência. Aproximadamente 10-15% da população celular foi positiva.
- Células positivas colhidas diluídas em série, semear a uma média de 0,5-2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultivar em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 6%. Mantenha as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estável usando a seleção com G418 (200 μg / mL).
- A concentração de FBS no meio de cultura celular descrito acima diminui gradualmente de 10% para 0% durante a fase de crescimento logarítmico durante o período de 3 semanas. Em seguida, adapte as células CHO aderentes ao crescimento em suspensão em meio sem soro.
- Cultivar as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO semeadas na fase de crescimento logarítmico em meio isento de soro a uma densidade de 0,8-1,0 × 105 células/mL em frascos agitados a 80-110 rpm de velocidade de agitação e 37°C, 6% CO2.
- Colete a suspensão celular a cada 12 h para determinar as mudanças na viabilidade e vitalidade celular usando um kit de contagem de células (por exemplo, CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante.
- A expressão de anticorpos atinge níveis máximos quando a viabilidade celular diminui para 80% e a densidade celular atinge 1,0-2,0 × 106 células/mL. Colher sobrenadantes de células por centrifugação, filtrar com um filtro de membrana de politetrafluoretileno de 0,22 μm e purificar com agarose proteína A.
- Confirme a produção de anticorpos específicos para APN usando ensaios de imunofluorescência indireta (IFA).
- Determine os títulos de anticorpos e as afinidades de ligação usando o ensaio ELISA, conforme descrito anteriormente. Calcule a constante de dissociação de equilíbrio (valor KD) dos anticorpos com uma equação logística de quatro parâmetros usando software.
Tabela 1. Os primers específicos utilizados neste estudo.
| cartilha | Sequência (5'-3') |
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG |
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT |
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC |
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC |
