Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento de PBMCs e enriquecimento/purificação de células NK
NOTA: Outros métodos para o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e enriquecimento/purificação também podem ser realizados.
- Retire 200 mL de sangue sob condições reguladas em um tubo contendo heparina.
- Adicione 15 mL do meio gradiente de densidade em um tubo de 50 mL com uma barreira porosa incorporada. Gire o tubo a 1000 x g por 30 s.
- Adicione 12,5 mL de sangue no tubo, seguido por outros 12,5 mL de PBS e inverta suavemente 3x. Gire o tubo a 800 x g por 15 min em temperatura ambiente (RT) sem pausas.
- Prepare um tubo cônico de 50 mL com 40 mL de PBS para cada tubo com uma barreira porosa enquanto as células estão girando.
- Remova cuidadosamente os tubos e inspecione após a centrifugação. Verifique se há uma camada fina e visivelmente branca de PBMCs acima da barreira porosa, entre as demarcações de 20 mL e 25 mL no tubo de 50 mL.
- Remova cuidadosamente o máximo de líquido possível da parte superior usando uma pipeta sem perturbar a fina camada branca de PBMC.
- Com uma pipeta sorológica limpa de 10 mL, remova suavemente a camada de PBMC, além da camada líquida clara e amarelada, até o filtro do tubo.
- Expulse os PBMCs e o líquido para o PBS cônico de 50 mL preparado na etapa 1.4. Gire os tubos em RT e 300 x g por 5 min.
- Aspire a lavagem com PBS e adicione mais 40 mL de PBS. Gire os tubos em RT e 300 x g por 5 min.
- Após a lavagem, conte as células e ressuspenda-as em 40 μL de BSA / PBS a 2% por 1 x 107 células.
- Proceda ao isolamento das células NK usando o método de escolha. As opções incluem classificação manual ou automatizada baseada em esferas magnéticas. A classificação de células ativadas por fluorescência também pode ser realizada.
- Remova uma pequena alíquota de células para determinar a pureza das células NK por citometria de fluxo. A estratégia de gating inclui o seguinte: porta em células vivas com base no perfil de dispersão direta versus lateral e, em seguida, avaliar a pureza com base nos marcadores NK (por exemplo, CD3, CD56) na população viva específica. A pureza típica é de >95%.
- Após a conclusão do isolamento, gire as células em RT e 300 x g por 5 min para granular e aspirar.
- Ressuspenda o pellet celular para 1 x 107 células/mL em RPMI 1640 com nutrientes, 10% de FBS inativado por calor, 1 mM de piruvato de sódio, 55 mM de 2-ME e 10 mM de HEPES (pH = 7,2).
2. Ativação mediada por anticorpos de células NK via FcγRIIIa
- Defina uma microcentrífuga refrigerada para 4 °C.
- Dispense 1 x 106 (100 μL de) células NK ressuspensas em tubo(s) de 1,5 mL e coloque no gelo.
nota: As células podem ser dispensadas em uma placa de fundo em U de 96 poços se houver várias amostras.
- Prepare 1 μL de rituximabe 100 μg/mL (ou anticorpo de interesse) por amostra e adicione 1 μL às células para uma concentração final de 1 μg/mL de anticorpo.
nota: Outras moléculas podem ser adicionadas às células neste ponto ou antes para a avaliação dos efeitos da combinação. Aqui, o ritixumabe foi usado para estimulação. Em estudos anteriores, inibidores de pequenas moléculas foram adicionados aos estímulos.
- Incubar a amostra no gelo durante 30 min. Durante a incubação, preparar 50 μl de anticorpo de cadeia leve κ humano 50 μg/ml por amostra em meio e aquecer a 37 °C num bloco de calor ou num banho-maria.
- Após a incubação das células no gelo, adicione 1 mL de meio gelado e gire a 135 x g por 5 min a 4 °C. Lave novamente com 1 mL de meio gelado.
- Aspirar o sobrenadante após a última lavagem e adicionar 50 μl da mistura de cadeia leve κ anti-humana preparada na etapa 2.4.
- Incubar imediatamente as amostras para os pontos de tempo determinados pelo utilizador final a 37 °C num bloco de calor ou em banho-maria.
- Pare a estimulação adicionando 1 mL de meio gelado e gire imediatamente as amostras em uma centrífuga refrigerada a 135 x g por 5 min. Lave mais uma vez com 1 mL de meio gelado.
