Uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno

Resumo

Fonte: Devilder, M., et al. Geração de anticorpos monoclonais humanos discriminativos a partir de células B específicas de antígenos raros circulando no sangue. J. Vis. Exp. (2018).

O vídeo demonstra uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno. Vetores de expressão eucarióticos que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos, clonados a partir de células B específicas de antígenos isolados, são introduzidos em células de mamíferos usando poliplexos. Uma vez dentro das células, esses vetores sofrem tradução, e os peptídeos de cadeia pesada e leve resultantes se reúnem em anticorpos, que são posteriormente secretados pelas células.

Protocolo

1. Produção de mAbs

1. No dia anterior à transfecção, semeie 15.000 células de rim embrionário humano 293A (HEK 293A) em 200 μL do meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS por poço em placas de 96 poços. Incubar durante a noite em uma incubadora de CO₂ (5% CO₂) a 37 °C.
2. Células 293A cotransfectadas em meio DMEM contendo 10% de FBS usando um derivado linear de polietilenimina como reagente de transfecção.
   nota: Realizar a transfecção em triplicatas. O protocolo a seguir é para um poço de uma placa de fundo plano de 96 poços.
   1. Diluir 0,5 μL de reagente de transfecção de DNA em 10 μL de NaCl 150 mM. Diluir 0,125 μg de vetores de cadeia pesada variável (vH) e 0,125 μg de cadeia leve variável (vL) expressando vetores em 10 μL de NaCl 150 mM. Vórtice de cada diluição por 10 s.
   2. Adicione 10 μL de reagente de transfecção de DNA diluído na solução de DNA de 10 μL. Vórtice 15 s e incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicione a mistura de 20 μL gota a gota nas células 293A e misture girando suavemente a placa.
3. Substituir o meio 16 h após a transfecção e cultivar células por 5 dias em meio sem soro.
   nota: Use meio sem soro para evitar que as imunoglobulinas séricas (Igs) contaminem os anticorpos produzidos.
4. Elimine células e detritos por centrifugação a 460 x g por 5 min.
5. Colha sobrenadantes por aspiração com uma pipeta multicanal e transfira-os para uma placa de 96 poços com fundo em V.
6. Revestir Ag relevante durante a noite a 4 °C em 100 μL por poço de ensaio de imunoabsorção enzimática reconstituída (ELISA)/tampão de revestimento de ponto de imunoabsorção enzimática (ELISPOT) 1x a uma concentração final de 2 μg/mL em placas ELISA de 96 poços.
7. Bloqueie os poços com 10% de meio FBS DMEM por 2 h a 37 °C.
8. Adicione 50 μL de sobrenadantes de células 293A transfectadas da etapa 1.5 e incube por 2 h em RT.
9. Adicione 100 μL de um anticorpo anti-imunoglobulina G humana (IgG Ab) conjugado à enzima peroxidase de rábano (HRP) a 1 μg/mL e incube por 1 h em temperatura ambiente. Adicionar 50 μL de substrato cromogénico (3,3',5,5' tetrametilbenzidina, TMB) e incubar durante 20 min.
10. Leia densidades ópticas a 450 nm em um espectrofotômetro.
    nota: Os mAbs específicos revelados pelo ensaio ELISA podem ser produzidos em larga escala e purificados na coluna de proteína A apresentando afinidade por IgG humana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular HEK 293A	Thermo Fisher científico	R70507
DMEM (1X) Meio de Águia Modificado de Dulbecco	Gibco por tecnologias de vida	Rolamento 21969-035	(+) 4,5g/L D-Glicose 0,11g/L de piruvato de sódio (-) L-Glutmina
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
Soro fetal bovino (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Reagente de transfecção de DNA Jet PEI	Mais	101-40
Placa de fundo planocom 96 poços	falcão	353072
Placa de 96 poços com fundo em V	Nunc/Thermofisher	Rolamento 55142

informações