Entrega de anticorpos aprimorada por convecção em um cérebro de camundongo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação dos cateteres escalonados

1. Preparação de um tubo de sílica fundida para a etapa do cateter
   1. Corte o capilar de sílica fundida com um diâmetro interno de 0,1 mm e espessura de parede de 0,0325 mm para um comprimento de 30 mm.
   2. Examine a tubulação em busca de rachaduras e polir as extremidades usando uma microforja para garantir que as aberturas da tubulação tenham uma superfície lisa.
2. Fixação do tubo interno em uma agulha de metal
   1. Montar uma agulha de 27 G numa seringa de 10 μL e colocar a seringa num robô estereotáxico.
   2. Usando o robô, mova a seringa sobre uma superfície dura e toque-a com a ponta da agulha. Essa posição deve ser anotada ou salva no software, pois servirá como superfície de referência para definir o comprimento do passo do cateter.
   3. Eleve a agulha para permitir que o capilar de sílica fundida seja colocado dentro da agulha.
   4. Colocar o capilar de sílica fundida na agulha de modo a que 20 mm do capilar fiquem salientes da agulha.
   5. Usando uma pipeta, espalhe uniformemente 2 μL de adesivo de cianoacrilato de alta viscosidade sobre o capilar, começando pela agulha de metal e terminando 10 mm acima da extremidade inferior do capilar, conforme ilustrado na Figura 1.
   6. Usando o robô estereotáxico, abaixe a agulha até que a ponta da agulha de metal esteja 1 mm acima da superfície de referência. Dessa forma, o capilar de sílica fundida será fixado na agulha metálica, formando um degrau de 1 mm a partir da ponta. Remova qualquer excesso de cola que se forme na extremidade da agulha de metal para evitar embotar o degrau.
   7. Aguarde 15 minutos para que a cola endureça e remova a seringa com o cateter do robô estereotáxico. Confirme se todo o excesso de cola foi removido na etapa, verificando a ponta do cateter ao microscópio.
3. Testando o cateter escalonado usando um bloco de agarose
   1. Prepare a solução de agarose a 0,6% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma bandeja de gel convencional e espere até que ela polimerize. Corte a agarose em blocos de aproximadamente 20 mm x 20 mm. Até o uso, mantenha os blocos imersos em PBS.
   2. Encha manualmente a seringa do cateter de degrau com 10 μL de solução a 0,4% de azul de tripano filtrado.
   3. Usando o robô estereotáxico, dispense 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução de azul de tripano deve ser visível apenas na ponta do cateter. Limpe-o com um lenço de papel.
   4. Coloque o bloco de agarose no robô estereotáxico e calibre o robô de forma que a ponta do cateter seja referenciada contra a superfície do bloco de agarose.
   5. Programe os parâmetros de injeção para CED.
      1. Para o volume de injeção de 5 μL, use as seguintes etapas: 1 μL a 0,2 μL/min, depois 2 μL a 0,5 μL/min e 2 μL a 0,8 μL/min. Ajuste o volume final de injeção de acordo com o plano experimental específico, alterando proporcionalmente a duração de cada uma das etapas.
      2. Para injetar a solução no putâmen caudado murino (estriado), execute essa injeção em uma posição 1 mm frontal e 1,5–2 mm lateral do bregma a uma profundidade de 3,5 mm.
      3. Após a injeção, deixe o cateter no lugar por 2 min e depois retraia a 1 mm/min para garantir a dispersão adequada do fluido no cérebro e selar o trato de injeção durante a remoção do cateter.
         nota: Todos os parâmetros podem ser programados em um único script, dependendo do robô estereotáxico específico.
   6. Inicie o procedimento CED e injete 5 μL de solução de azul de tripano no bloco de agarose.
   7. Avalie a forma de uma nuvem de azul de tripano na agarose e o possível vazamento ao longo do trato do cateter. O azul de tripano deve formar um elipsóide ou uma nuvem redonda com o centro ao redor da ponta do cateter e um diâmetro de pelo menos 1 mm. Nenhum grande refluxo sobre a ponta da agulha de metal deve ser visível.
   8. Coloque um novo bloco de agarose e inicie uma segunda injeção de 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar o entupimento do cateter com a agarose. O azul de tripano deve novamente começar a formar uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção.
   9. Avaliar se o volume restante na seringa corresponde a 3 μL. Quaisquer variações podem indicar vazamento de fluido através do suporte do cateter ou do êmbolo da seringa.
   10. Se todas as injeções de teste forem bem-sucedidas, o cateter está bem vedado e reto, e nenhuma solução de azul de tripano é observada em outros pontos além da ponta do cateter, lave o cateter com H₂O deionizado (dH₂O) até que nenhum vestígio de azul de tripano seja visível e, em seguida, lave dez vezes da seguinte forma: etanol 70% e etanol 100% seguido de lavagem novamente com etanol 70% e água deionizada limpa.
   11. Armazene o cateter em condições secas.

2. Entrega de solução de anticorpos aprimorada por convecção no cérebro murino

NOTA: Dependendo dos regulamentos locais de bem-estar animal, vários tipos de anestésicos, analgésicos e antibióticos podem ser implementados para este procedimento. Este protocolo descreve o uso de anestesia injetável. Anestésicos inalatórios, como o isoflurano, também podem ser usados montando uma máscara nasal na estrutura estereotáxica. Além disso, recomendamos adicionar antibióticos à água potável para profilaxia de infecções.

1. Configuração cirúrgica
   1. Prepare anestésicos e soluções de antídotos. Os camundongos podem ser anestesiados com segurança usando uma anestesia de três componentes contendo fentanil (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg) diluídos em água destilada estéril (dH₂O). Realizamos um procedimento de despertar em duas etapas usando duas soluções de antídoto, uma contendo flumazenil (0,5 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) em dH₂O estéril (primeira solução de antídoto). O segundo contém atipamezol (2,5 mg/kg) em dH₂O estéril (segunda solução de antídoto).
   2. Preparar uma solução de analgesia contendo carprofeno (5,667 mg/kg) diluído com dH₂O estéril.
   3. Limpe a estrutura estereotáxica, a almofada de aquecimento e os elementos do robô estereotáxico. Lembre-se de que nem todas as peças do robô podem ser limpas sem risco de danos. Consulte o manual do robô para obter detalhes sobre limpeza e preparação para uso.
   4. Monte a seringa com o cateter escalonado e lave-a várias vezes com dH₂O, etanol 70% e etanol 100%, seguido de lavagem novamente com etanol 70% e dH₂O. Finalmente, lave a seringa com PBS ou outros tampões para preparar a solução para injeção intracraniana, por exemplo,., líquido cefalorraquidiano artificial. O êmbolo da seringa deve se mover suave e livremente durante o procedimento.
   5. Calibre o software do robô estereotáxico com o quadro estereotáxico.
   6. Teste o software do robô estereotáxico garantindo que os braços do robô se movam livremente, que a bomba injetora esteja conectada adequadamente e que possa realizar o procedimento CED sem perturbações. Isso inclui testar o movimento do robô, aumentar a injeção, verificar a etapa de espera de 2 minutos e verificar a velocidade de retração do cateter. Todos os parâmetros devem corresponder ao procedimento CED pré-programado descrito no ponto 1.3.5.
   7. Insira a broca na broca. Recomenda-se esterilizar as brocas antes do uso.
   8. Prepare a solução de anticorpos usando PBS ou outras soluções tampão, como líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF). 1 a 20 μg de anticorpo em 5 μL podem ser injetados em um único procedimento de CED. Outros volumes e quantidades de proteína devem ser testados antes de realizar o experimento. Esteja ciente de que o uso de soluções de alta viscosidade pode levar ao entupimento do cateter.
   9. Carregue manualmente a seringa com o anticorpo diluído.
2. Injeção de anticorpos por CED no estriado
   1. Pese o camundongo e injete a solução anestésica de três componentes no peritônio de acordo com o peso corporal. Observe o tempo de injeção. Transfira o mouse para uma gaiola separada aquecida com uma almofada de aquecimento.
   2. Observe o mouse para determinar quando a sedação começa. Quando o camundongo parar de se mover, aplique pomada oftálmica nos olhos para proteger a córnea do ressecamento durante a cirurgia. A sedação completa geralmente começa 10 a 15 minutos após a injeção da solução anestésica de três componentes.
   3. Verifique as reações de dor usando o teste de reflexo de pinça para garantir a anestesia completa do animal.
   4. Raspe a cabeça usando um aparador de cabelo.
   5. Desinfete a pele com cotonetes embebidos em solução de iodo. Esfregue a pele três vezes em movimentos circulares.
   6. Faça uma incisão na pele de 10 mm ao longo da linha média craniana, terminando no nível dos olhos com bisturi.
   7. Fixe o mouse na estrutura estereotáxica usando o grampo do nariz e as barras auriculares. Certifique-se de que a superfície do crânio esteja horizontal e bem presa. Além da navegação anatômica correta, também é crucial evitar a inclinação do crânio durante a perfuração e o procedimento CED.
   8. Coloque a seringa no robô estereotáxico.
   9. Sincronize a broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. A relação entre a posição da broca e da seringa deve ser determinada com precisão no software para que a injeção possa ser realizada na região anatômica desejada do cérebro.
   10. Retraia a pele usando uma pinça e localize o bregma na superfície do crânio.
   11. Faça referência a Bregma no software usando a ponta da broca.
   12. Mova a broca para uma posição 1 mm frontal e 2 mm lateral do bregma e faça um furo de rebarba. Tenha cuidado para não danificar a dura-máter.
   13. Mova a seringa sobre o orifício da rebarba.
   14. Dispense 0,5–1 μL da seringa para garantir que não fiquem bolhas de ar no cateter.
   15. Inicie o programa CED descrito no ponto 1.3.5. Observe a superfície do crânio em busca de vestígios de refluxo de fluido do local de injeção. Monitore a frequência respiratória do animal.
   16. Assim que o programa CED terminar e o cateter for retirado do cérebro, inicie a bomba injetora a 0,2 μL/min para verificar se há entupimento do cateter durante o CED. Se não ocorrer entupimento, você deverá ver imediatamente uma gota de mistura de injeção na ponta do cateter.
   17. Antes de reutilizar ou armazenar o cateter, examine visualmente a etapa do cateter sob um microscópio quanto a sinais de danos ou desgaste e limpe-a como na etapa 1.3.10.

Figura 1: Um desenho esquemático representando a área de aplicação do adesivo. Os 10 mm superiores do tubo de sílica fundida são inseridos na agulha de metal. Aplique a cola no tubo de 10 mm a partir da ponta da agulha de metal.