Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação dos cateteres escalonados
- Preparação de um tubo de sílica fundida para a etapa do cateter
- Corte o capilar de sílica fundida com um diâmetro interno de 0,1 mm e espessura de parede de 0,0325 mm para um comprimento de 30 mm.
- Examine a tubulação em busca de rachaduras e polir as extremidades usando uma microforja para garantir que as aberturas da tubulação tenham uma superfície lisa.
- Fixação do tubo interno em uma agulha de metal
- Montar uma agulha de 27 G numa seringa de 10 μL e colocar a seringa num robô estereotáxico.
- Usando o robô, mova a seringa sobre uma superfície dura e toque-a com a ponta da agulha. Essa posição deve ser anotada ou salva no software, pois servirá como superfície de referência para definir o comprimento do passo do cateter.
- Eleve a agulha para permitir que o capilar de sílica fundida seja colocado dentro da agulha.
- Colocar o capilar de sílica fundida na agulha de modo a que 20 mm do capilar fiquem salientes da agulha.
- Usando uma pipeta, espalhe uniformemente 2 μL de adesivo de cianoacrilato de alta viscosidade sobre o capilar, começando pela agulha de metal e terminando 10 mm acima da extremidade inferior do capilar, conforme ilustrado na Figura 1.
- Usando o robô estereotáxico, abaixe a agulha até que a ponta da agulha de metal esteja 1 mm acima da superfície de referência. Dessa forma, o capilar de sílica fundida será fixado na agulha metálica, formando um degrau de 1 mm a partir da ponta. Remova qualquer excesso de cola que se forme na extremidade da agulha de metal para evitar embotar o degrau.
- Aguarde 15 minutos para que a cola endureça e remova a seringa com o cateter do robô estereotáxico. Confirme se todo o excesso de cola foi removido na etapa, verificando a ponta do cateter ao microscópio.
- Testando o cateter escalonado usando um bloco de agarose
- Prepare a solução de agarose a 0,6% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma bandeja de gel convencional e espere até que ela polimerize. Corte a agarose em blocos de aproximadamente 20 mm x 20 mm. Até o uso, mantenha os blocos imersos em PBS.
- Encha manualmente a seringa do cateter de degrau com 10 μL de solução a 0,4% de azul de tripano filtrado.
- Usando o robô estereotáxico, dispense 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução de azul de tripano deve ser visível apenas na ponta do cateter. Limpe-o com um lenço de papel.
- Coloque o bloco de agarose no robô estereotáxico e calibre o robô de forma que a ponta do cateter seja referenciada contra a superfície do bloco de agarose.
- Programe os parâmetros de injeção para CED.
- Para o volume de injeção de 5 μL, use as seguintes etapas: 1 μL a 0,2 μL/min, depois 2 μL a 0,5 μL/min e 2 μL a 0,8 μL/min. Ajuste o volume final de injeção de acordo com o plano experimental específico, alterando proporcionalmente a duração de cada uma das etapas.
- Para injetar a solução no putâmen caudado murino (estriado), execute essa injeção em uma posição 1 mm frontal e 1,5–2 mm lateral do bregma a uma profundidade de 3,5 mm.
- Após a injeção, deixe o cateter no lugar por 2 min e depois retraia a 1 mm/min para garantir a dispersão adequada do fluido no cérebro e selar o trato de injeção durante a remoção do cateter.
nota: Todos os parâmetros podem ser programados em um único script, dependendo do robô estereotáxico específico.
- Inicie o procedimento CED e injete 5 μL de solução de azul de tripano no bloco de agarose.
- Avalie a forma de uma nuvem de azul de tripano na agarose e o possível vazamento ao longo do trato do cateter. O azul de tripano deve formar um elipsóide ou uma nuvem redonda com o centro ao redor da ponta do cateter e um diâmetro de pelo menos 1 mm. Nenhum grande refluxo sobre a ponta da agulha de metal deve ser visível.
- Coloque um novo bloco de agarose e inicie uma segunda injeção de 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar o entupimento do cateter com a agarose. O azul de tripano deve novamente começar a formar uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção.
- Avaliar se o volume restante na seringa corresponde a 3 μL. Quaisquer variações podem indicar vazamento de fluido através do suporte do cateter ou do êmbolo da seringa.
- Se todas as injeções de teste forem bem-sucedidas, o cateter está bem vedado e reto, e nenhuma solução de azul de tripano é observada em outros pontos além da ponta do cateter, lave o cateter com H2O deionizado (dH2O) até que nenhum vestígio de azul de tripano seja visível e, em seguida, lave dez vezes da seguinte forma: etanol 70% e etanol 100% seguido de lavagem novamente com etanol 70% e água deionizada limpa.
- Armazene o cateter em condições secas.
2. Entrega de solução de anticorpos aprimorada por convecção no cérebro murino
NOTA: Dependendo dos regulamentos locais de bem-estar animal, vários tipos de anestésicos, analgésicos e antibióticos podem ser implementados para este procedimento. Este protocolo descreve o uso de anestesia injetável. Anestésicos inalatórios, como o isoflurano, também podem ser usados montando uma máscara nasal na estrutura estereotáxica. Além disso, recomendamos adicionar antibióticos à água potável para profilaxia de infecções.
- Configuração cirúrgica
- Prepare anestésicos e soluções de antídotos. Os camundongos podem ser anestesiados com segurança usando uma anestesia de três componentes contendo fentanil (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg) diluídos em água destilada estéril (dH2O). Realizamos um procedimento de despertar em duas etapas usando duas soluções de antídoto, uma contendo flumazenil (0,5 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) em dH2O estéril (primeira solução de antídoto). O segundo contém atipamezol (2,5 mg/kg) em dH2O estéril (segunda solução de antídoto).
- Preparar uma solução de analgesia contendo carprofeno (5,667 mg/kg) diluído com dH2O estéril.
- Limpe a estrutura estereotáxica, a almofada de aquecimento e os elementos do robô estereotáxico. Lembre-se de que nem todas as peças do robô podem ser limpas sem risco de danos. Consulte o manual do robô para obter detalhes sobre limpeza e preparação para uso.
- Monte a seringa com o cateter escalonado e lave-a várias vezes com dH2O, etanol 70% e etanol 100%, seguido de lavagem novamente com etanol 70% e dH2O. Finalmente, lave a seringa com PBS ou outros tampões para preparar a solução para injeção intracraniana, por exemplo,., líquido cefalorraquidiano artificial. O êmbolo da seringa deve se mover suave e livremente durante o procedimento.
- Calibre o software do robô estereotáxico com o quadro estereotáxico.
- Teste o software do robô estereotáxico garantindo que os braços do robô se movam livremente, que a bomba injetora esteja conectada adequadamente e que possa realizar o procedimento CED sem perturbações. Isso inclui testar o movimento do robô, aumentar a injeção, verificar a etapa de espera de 2 minutos e verificar a velocidade de retração do cateter. Todos os parâmetros devem corresponder ao procedimento CED pré-programado descrito no ponto 1.3.5.
- Insira a broca na broca. Recomenda-se esterilizar as brocas antes do uso.
- Prepare a solução de anticorpos usando PBS ou outras soluções tampão, como líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF). 1 a 20 μg de anticorpo em 5 μL podem ser injetados em um único procedimento de CED. Outros volumes e quantidades de proteína devem ser testados antes de realizar o experimento. Esteja ciente de que o uso de soluções de alta viscosidade pode levar ao entupimento do cateter.
- Carregue manualmente a seringa com o anticorpo diluído.
- Injeção de anticorpos por CED no estriado
- Pese o camundongo e injete a solução anestésica de três componentes no peritônio de acordo com o peso corporal. Observe o tempo de injeção. Transfira o mouse para uma gaiola separada aquecida com uma almofada de aquecimento.
- Observe o mouse para determinar quando a sedação começa. Quando o camundongo parar de se mover, aplique pomada oftálmica nos olhos para proteger a córnea do ressecamento durante a cirurgia. A sedação completa geralmente começa 10 a 15 minutos após a injeção da solução anestésica de três componentes.
- Verifique as reações de dor usando o teste de reflexo de pinça para garantir a anestesia completa do animal.
- Raspe a cabeça usando um aparador de cabelo.
- Desinfete a pele com cotonetes embebidos em solução de iodo. Esfregue a pele três vezes em movimentos circulares.
- Faça uma incisão na pele de 10 mm ao longo da linha média craniana, terminando no nível dos olhos com bisturi.
- Fixe o mouse na estrutura estereotáxica usando o grampo do nariz e as barras auriculares. Certifique-se de que a superfície do crânio esteja horizontal e bem presa. Além da navegação anatômica correta, também é crucial evitar a inclinação do crânio durante a perfuração e o procedimento CED.
- Coloque a seringa no robô estereotáxico.
- Sincronize a broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. A relação entre a posição da broca e da seringa deve ser determinada com precisão no software para que a injeção possa ser realizada na região anatômica desejada do cérebro.
- Retraia a pele usando uma pinça e localize o bregma na superfície do crânio.
- Faça referência a Bregma no software usando a ponta da broca.
- Mova a broca para uma posição 1 mm frontal e 2 mm lateral do bregma e faça um furo de rebarba. Tenha cuidado para não danificar a dura-máter.
- Mova a seringa sobre o orifício da rebarba.
- Dispense 0,5–1 μL da seringa para garantir que não fiquem bolhas de ar no cateter.
- Inicie o programa CED descrito no ponto 1.3.5. Observe a superfície do crânio em busca de vestígios de refluxo de fluido do local de injeção. Monitore a frequência respiratória do animal.
- Assim que o programa CED terminar e o cateter for retirado do cérebro, inicie a bomba injetora a 0,2 μL/min para verificar se há entupimento do cateter durante o CED. Se não ocorrer entupimento, você deverá ver imediatamente uma gota de mistura de injeção na ponta do cateter.
- Antes de reutilizar ou armazenar o cateter, examine visualmente a etapa do cateter sob um microscópio quanto a sinais de danos ou desgaste e limpe-a como na etapa 1.3.10.
