1. Cultura de células de microglia BV-2
NOTA: Manuseie as células BV-2 sob contenção de nível de biossegurança 2. A linha celular BV-2 produz um retrovírus ecotrópico recombinante envelopado (capaz de infectar apenas células murinas); Tais vírus são conhecidos por sua capacidade de transformação in vitro e potencial tumorigênico in vivo.
- Cultura de células BV-2 em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina (doravante denominado meio de cultura) por meio da semeadura de células a 4 x 104 células/mL.
- Manter as culturas em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C.
NOTA: as células crescem frouxamente presas e em suspensão.
2. Rotular agregados Tau recombinantes com corante fluorescente sensível ao pH
NOTA: Os agregados de Tau foram preparados conforme descrito em Apetri et al.com a diferença de que nenhuma tioflavina T (ThT) foi adicionada ao tampão de reação. As amostras agregadas foram coletadas em tubos de centrífuga de 1,5 mL. O sinal de fluorescência final foi verificado misturando 118 μL da amostra do pool com 12 μL de uma solução de 50 μM ThT. Os agregados foram separados por centrifugação da mistura de reação de agregação a 20.000 x g por 1 h a 4 °C. O sobrenadante foi analisado por SEC-MALS para confirmar que todo o tau monomérico foi convertido em agregados. Os pellets (agregados tau) foram congelados e armazenados em freezer a -80 °C.
- Ressuspender agregados de tau em tampão bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3) a pH 8,5 até uma concentração de 1 mg/mL (~ 20 μM).
nota: A concentração de agregados de tau é baseada na concentração inicial de monômeros avaliada pela absorção de monômeros de tau a 280 nm usando um coeficiente de extinção de 0,31 mLmg-1 cm-1.
- Sonicar os agregados ressuspensos usando um sonicador de sonda, mantendo-os no gelo para evitar superaquecimento.
- Use uma amplitude de 65% (com um sonicador de potência 250 W).
- Execute 8 pulsos de 3 s com pausas de 15 s entre os pulsos para evitar superaquecimento.
- Prepare uma solução estoque de 8,9 mM de corante sensível ao pH (doravante denominada corante de pH) em dimetilsulfóxido (DMSO) seguindo as instruções do fabricante.
nota: Sempre prepare uma solução nova e use-a apenas no dia em que for preparada.
- Adicione 10 moles de corante por mol de proteína a uma concentração final de corante de 0,2 mM.
- Misture pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Incube a mistura de reação por 45–60 min em temperatura ambiente, protegida da luz.
- Enquanto isso, monte uma coluna de dessalinização em gel de dextrano reticulado seguindo as instruções do fabricante.
- Equilibre a coluna com 25 mL de tampão NaHCO3 0,1 M pH 8,5 contendo 3% de DMSO. Descarte o fluxo.
- Adicione o produto da reação de marcação agregada tau à coluna em um volume total de 2,5 mL. Se a amostra for inferior a 2,5 mL, adicione tampão até atingir um volume total de 2,5 mL.
- Deixe a amostra entrar completamente no gel embalado, descarte o fluxo.
- Eluir com 3,5 mL de tampão NaHCO3 0,1 M pH 8,5 contendo 3% de DMSO e coletar o eluído em 4 frações equivalentes em tubos de 2 mL.
- Determine as concentrações de proteína das 4 frações pelo ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
- Armazene a proteína rotulada em um freezer a -20 °C.
3. Ensaio de captação com leitura de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
- Dia 1 – Semeie as células
- Lave as células BV-2 no frasco removendo o meio de cultura e adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
nota: O volume de lavagem varia de acordo com o tamanho do frasco de célula usado. Por exemplo, para um frasco T175, lave com 10 mL de 1x PBS.
- Remova o PBS do frasco e desprenda as células incubando com ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,05% a 37 ° C e 5% CO2 até que as células se desprendam do frasco (aproximadamente 5 min).
nota: O volume de tripsina-EDTA 0,05% depende do tamanho do frasco celular usado. Por exemplo, para um balão T175, use 2 mL de tripsina-EDTA 0,05%.
- Ressuspenda as células em meio de cultura pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes.
NOTA: O volume do meio de cultura varia de acordo com o tamanho do frasco de células usado e, portanto, o número total de células no frasco. Por exemplo, para um frasco T175, use 8 mL de meio de cultura.
- Contar as células e criar uma suspensão celular com uma concentração final de 1 x 105 células/ml em meio de cultura contendo 200 μg/ml de heparina.
- Placa 250 μL de suspensão celular (2,5 x 104 células) por poço em uma placa de fundo plano de cultura de tecidos de 96 poços.
- Incubar a placa durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- Dia 1 – Preparar imunocomplexos
- Descongele o corante de pH-tau no gelo.
- Prepare 65 μl por condição de uma solução de 500 nM de agregados de corante de pH-tau em meio livre de soro (SFM) (DMEM de alta glicose suplementado com 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 200 μg / mL de heparina).
- Preparar diluições de anticorpos em 65 μl de SFM a uma concentração duas vezes superior à final. Misture agregados de corante de pH-tau e anticorpos em uma placa de fundo em U de 96 poços. O volume final por condição é agora de 130 μl e a concentração de agregados de corante tau de pH é de 250 nM. Selar a placa de diluição e incubar durante a noite a 37 °C.
- Dia 2 – Absorção de imunocomplexos
- Remova o meio de cultura das células BV-2. Lave as células uma vez com 100 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
- Transfira 125 μL de imunocomplexos para as células usando uma pipeta multicanal. Incubar as células com os imunocomplexos durante 2 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova o meio de incubação das células e descarte-o. Lave as células uma vez com 100 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
- Remova 1x PBS e trate as células com 50 μL de tripsina-EDTA 0,25% por 20 min a 37 ° C e 5% de CO2.
- Adicione 200 μL de meio de cultura e ressuspenda bem pipetando para cima e para baixo para separar as células. Transfira as células para uma placa de fundo em U de 96 poços. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque a placa no gelo, remova o meio de cultura e lave as células duas vezes, ressuspendendo os pellets celulares em 150 μL gelados 1x PBS. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque as células no gelo, remova 1x PBS adicionado e lave-as ressuspendendo os pellets de células em 150 μL de tampão FACS frio (1x PBS, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mM de EDTA). Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque as células no gelo, remova o tampão FACS adicionado e ressuspenda as células em tampão FACS frio de 200 μL.
- Analise amostras imediatamente por FACS adquirindo 2 x 104 eventos na porta de células vivas (consulte a etapa 4.1).
