1. Purificação de anticorpos
NOTA: O tampão de equilíbrio para o anticorpo interno é 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. O tampão de eluição usado é o ácido acético 0,1 M. Os tampões e a resina (proteína A) dependem do anticorpo específico purificado. O volume da coluna é equivalente à altura do leito da resina. A quantidade de fase móvel usada é determinada em termos de volume da coluna.
- Inicializando o sistema de purificação
- Abra o software conectado ao sistema de purificação. Usando instruções manuais, equilibre a coluna com o tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 2 mL / min por 40 min. Pare a corrida manual após o equilíbrio.
- No coletor de frações, coloque tubos cônicos de 15 mL para coletar o eluato de anticorpos purificado e tubos cônicos de 50 mL para coletar o fluxo durante a lavagem com alto teor de sal. Certifique-se de que o coletor de frações seja redefinido para a posição inicial, abrindo e fechando o coletor de frações antes do início da execução. O coletor de frações é mantido a 7 °C.
nota: O coletor de frações pode ser redefinido manualmente na guia Coletor de frações em Configurações, para tubos de 15 mL e 50 mL.
- Injeção de amostra
nota: O fluido de cultura de células colhidas usado nos procedimentos a seguir foi obtido de células de ovário de hamster chinês cultivadas em microbiorreatores automatizados.
- Adicione o fluido de cultura de células de colheita filtrado de 0,22 μm a uma seringa vazia de 12 mL cuja extremidade do bico esteja tampada.
- Segurando a seringa com o bico voltado para baixo, insira o êmbolo da seringa até que uma pequena parte do êmbolo esteja dentro. Certificando-se de que o fluido não está vazando, gire a seringa com o bico voltado para cima e remova a tampa.
- Ainda segurando a seringa com o bico voltado para cima, empurre o cilindro para dissipar o ar até que o fluido de cultura de células esteja na ponta do bico. Insira o bico da seringa na porta de injeção manual do sistema de purificação e gire para apertar.
- Empurre o êmbolo para baixo até que toda a amostra seja injetada e fique visível no loop de amostra de grande volume de 10 mL anexado.
- Abra o arquivo de método salvo. Salve o arquivo de resultado no local desejado e especifique o nome do arquivo quando solicitado. Execução de ocorrências após a amostra ter sido injetada no loop de amostra de grande volume.
- Executando o método de purificação
- Selecione o método salvo e clique em executar quando solicitado pelo software do instrumento (passo 1.2.5).
nota: O sistema está configurado para executar as etapas a seguir. O usuário não precisa fazer nada enquanto o instrumento estiver funcionando.
- Equilibre a coluna com três volumes de coluna (CVs) de tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 2 mL / min. Uma vez que a coluna esteja equilibrada, o sistema, usando o loop de amostra de grande volume, injetará a amostra na coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL / min.
- Uma queda no sinal UV a 280 nm indica que a amostra terminou de carregar. Lave a coluna com tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 2 mL / min até que o sinal UV caia abaixo de 25 mAU.
- Use quatro CVs de Tris 25 mM com NaCl 1 M em pH 7.5 para realizar uma lavagem secundária com alto teor de sal a uma taxa de fluxo de 2 mL / min. O coletor de frações do sistema coletará qualquer proteína/DNA que saia da coluna durante a lavagem do sal em tubos de 50 mL.
- Aplique cinco CVs de tampão de eluição a uma taxa de fluxo de 1 mL / min para eluir o anticorpo da coluna. Colete o eluído em tubos de 15 mL com base no sinal UV; quando o sinal UV 280 está acima de 35 mAU, a coleta é iniciada; a coleta termina quando o sinal cai abaixo de 50 mAU; Isso é chamado de corte de pico.
nota: O corte de pico garante a normalização dos perfis de eluição e evita o rejeito de pico de eluição, que pode conter agregados de proteínas.
- Lavar a coluna com três CV de tampão de equilíbrio. A corrida termina após a etapa de lavagem.
- Após a eluição, neutralize imediatamente a proteína purificada usando 1 M Tris base a um pH de ~ 5,5. Medir a concentração de proteínas utilizando um espectrofotómetro UV-Vis de microvolume a 280 nm e 260 nm e conservar a 4 °C.
