Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
PARTE 1: Estabelecimento de culturas neuronais dissociadas do hipocampo fetal, de roedores
1. Etapas preparatórias
- Revestimento de poli-L-lisina (PLL) das superfícies de revestimento (3 dias antes da dissecção)
- Prepare o tampão borato adicionando 2,38 g de ácido bórico e 1,27 g de bórax a 500 mL de água destilada e mexendo por 15 min até dissolver. Sob um capuz, esterilize a solução tampão filtrando (tamanho de poro de 0,2 μm), rotule e armazene em temperatura ambiente (RT).
nota: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses.
CUIDADO: Ao preparar o tampão de borato, use o equipamento de proteção individual recomendado.
- Prepare a solução-mãe de PLL (100 mg / mL) adicionando 1 g de PLL a 10 mL de água destilada e mexendo até dissolver. Preparar alíquotas de 500 μL da solução-mãe de PLL. Para atingir uma concentração final de 1 mg/mL, adicione 500 μL de alíquota de PLL a 50 mL de tampão borato e agite até dissolver, e esterilize a solução filtrando (tamanho de poro de 0,2 μm).
nota: Esta solução é estável e pode ser usada por 6 meses.
- Prepare as superfícies para o revestimento. Use lamínulas de 12 mm de diâmetro para procedimentos de imunocoloração e placas com fundo de vidro para estudos que incluirão a imagem de neurônios vivos. Se estiver usando lamínulas, autoclave e coloque cinco lamínulas em cada prato (3,5 cm de diâmetro).
nota: A espessura da lamínula afeta a qualidade e a intensidade do sinal das imagens adquiridas. A maioria das objetivas de microscópio é projetada para lamínulas #1.5. Escolha as lamínulas apropriadas de acordo com a configuração e as técnicas de imagem.
- Sob um capô, adicione 1,5 mL de solução PLL a cada prato (prato com fundo de vidro ou prato de 3,5 cm com cinco lamínulas). Certifique-se de que todas as lamínulas estejam submersas e armazenadas em RT por 24 h.
- 2 dias antes da dissecção, aspire a solução de PLL e lave com água estéril livre de endotoxinas, certificando-se de que as lamínulas estejam submersas. Mantenha a água na loiça e guarde em RT durante 24 h.
- 1 dia antes da dissecação, aspirar a água e substituí-la por meios de cultura NB + B27 (ver abaixo) e colocar as placas numa estufa a 37 °C durante 24 h.
- Preparação de meios de cultura e solução estoque (1 dia antes da dissecção)
- Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM): Para 500 mL de DMEM High Glucose (4,5 g/L) sem L-Glutamina e vermelho de fenol, adicione 50 mL de soro de cavalo, 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sódio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar (tamanho de poro de 0,2 μm) e armazenar em alíquotas de 5 ml a 4 oC com uma tampa bem fechada.
nota: Esta solução é estável e pode ser usada por 1 mês.
- Meio neurobasal (NB) suplementado com B27 (NB + B27): Para 50 mL de meio NB sem vermelho de fenol, adicione 1 mL de suplemento de B27.
- Meio Hibernate-E suplementado com B27 (Hibernate + B27): Para 50 mL de meio Hibernate-E, adicione 1 mL de suplemento B27.
- Solução Fisiológica Extracelular (EPS): A 1 L de água estéril, adicione o seguinte nas concentrações finais especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanossulfônico) (HEPES, 10 mM), glicose (20 mM) e CaCl2 (2 mM). Mexa até dissolver e ajuste o pH para 7,4 adicionando NaOH (0,5 M) ou HCl (0,5 M). Sob o capô, esterilize filtrando (tamanho de poro de 0,2 μm) e armazene a 4°C.
- Equipamentos e outros materiais de laboratório (dia da dissecação)
- Defina um banho-maria para 37 °C. Aqueça as seguintes alíquotas: 50 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) e 5 mL de DMEM.
- Esterilize as seguintes ferramentas imergindo em um béquer contendo etanol absoluto (Figura 1B): pinça, pinça curva, tesoura, pinça curva fina, pinça reta fina, tesoura cirúrgica, pinça angular fina e tesoura de mola de precisão.
nota: Para proteger as ferramentas, coloque um material macio (por exemplo, lenços de precisão científica) na parte inferior do copo.
- Encha duas bandejas com gelo e coloque os seguintes itens.
- Bandeja de gelo 1 (Figura 1C): Coloque as ferramentas cirúrgicas no copo com etanol absoluto, um copo com HBSS para enxaguar as ferramentas cirúrgicas, uma placa de 10 cm com HBSS para colocar os embriões, uma placa de 6 cm com HBSS para colocar as cabeças dos embriões e uma placa de 6 cm com Hibernate + B27 para colocar os cérebros dos embriões.
- Bandeja de gelo 2: Coloque uma alíquota de 1 mL de tripsina 2,5% e uma placa de 3,5 cm com Hibernate + B27 para o hipocampo dissecado.
nota: O tempo necessário para este procedimento depende da experiência do investigador e do número de embriões a serem dissecados. Portanto, o gelo deve permanecer congelado pelo tempo necessário. Bandejas de poliestireno são recomendadas para esse fim.
2. Dissecção e semeadura (Figura 1)
- Isolamento hipocampal
nota: Ratos prenhes com embriões no dia embrionário 18 (E18) são sacrificados imediatamente antes do início do protocolo, de acordo com o comitê de ética local da Universidade de Barcelona, seguindo os regulamentos europeus (2010/63/UE) sobre o uso e cuidados com animais experimentais. Nesse protocolo, a inalação de dióxido de carbono (CO2) foi utilizada como método de eutanásia.
- Disseque o rato ao nível do peritônio abdominal usando uma pinça e uma tesoura. Extraia o útero com os embriões E18 e coloque-o em uma placa de 10 cm resfriada sobre gelo.
NOTA: É importante evitar que os pêlos dos ratos se prendam aos embriões. Recomenda-se o uso de grandes quantidades de etanol a 70% para esterilizar o abdômen. A partir desta etapa, trabalhe dentro do exaustor na bandeja de gelo 1.
- Abra os sacos embrionários e transfira os embriões para a placa de 10 cm com HBSS, certificando-se de que os embriões estejam totalmente imersos.
- Retire a cabeça do embrião com uma tesoura e coloque-a no prato de 6 cm com HBSS. Repita esse processo com todos os embriões.
nota: Para evitar contaminação, todos os tecidos, exceto as cabeças dos embriões, devem ser descartados em um recipiente com tampa de rosca.
- Segure a cabeça do embrião com uma pinça de curva fina e perfure as órbitas com um par de pinças retas finas, entrando em um ângulo de 45° e, em seguida, solte a pinça de curva fina.
nota: A pinça não deve passar pelo cérebro, por isso é importante manter o ângulo ao entrar.
- Disseque a pele e o crânio com a tesoura cirúrgica, começando do osso occipital até o osso frontal. Remova o cérebro com uma pinça de curva fina e coloque-o no prato de 6 cm com Hibernate + B27. Repita esse processo até que todos os cérebros estejam recuperados.
- Separe sagitalmente os telencéfalos com a pinça fino-reta.
nota: A partir desta etapa, a dissecção do hipocampo é realizada sob um estereomicroscópio. Recomenda-se o uso de lâmpadas articuladas para que a luz ilumine a superfície de dissecção pelos lados. Também é recomendável usar um fundo preto, pois isso fornece mais contraste, permitindo distinguir melhor o hipocampo.
- Prepare um prato de 10 cm colocando gotas de Hibernate + B27 a distâncias de 1 cm (por exemplo, em círculo). Coloque um telencéfalo por gota de Hibernate + B27 e visualize através do escopo de dissecação (recomenda-se uma ampliação objetiva de 1,25x).
- Descasque cuidadosamente as meninges e remova o tálamo para visualizar melhor o hipocampo.
- Disseque o hipocampo com a tesoura de mola de precisão e coloque-o no prato de 3,5 cm com Hibernate + B27 na bandeja de gelo 2. Repita para cada telencéfalo até que todos os hipocampos sejam coletados.
- Colete cuidadosamente todos os hipocampos com uma pipeta Pasteur e transfira-os para um tubo de 50 mL.
nota: Tome o volume mínimo de Hibernate + B27 ao coletar o hipocampo para não diluir a tripsina.
- Dissociação celular
- Dissociação enzimática do hipocampo
- No tubo de 50 mL contendo o hipocampo, adicione 1 mL de tripsina a 2,5% e leve a um volume de 5 mL com HBSS. Incubar durante 15 min em banho-maria a 37 °C.
- Para diluir a tripsina, adicionar 10 ml de HBSS pré-aquecido e incubar durante 5 min em banho-maria a 37 °C.
- Transfira os hipocampos que agora aparecem como uma massa de muco para um tubo de 50 mL com uma micropipeta de 1.000 μL, adicione 6 mL de HBSS pré-aquecido e incube por 5 min no banho-maria a 37 ° C.
- Dissociação mecânica do hipocampo
- Transferir a massa para um tubo de 2 mL com fundo cônico, tomando o volume mínimo. Adicione 1 mL de meio DMEM pré-aquecido. Homogeneizar o pellet com uma micropipeta de 1.000 μL aspirando suavemente para cima e para baixo.
nota: É fundamental evitar a geração de bolhas ao aspirar, pois as bolhas podem lisar as células.
- Repita a aspiração para cima e para baixo com uma pipeta de vidro pré-puxada (10x-20x), com a ponta em contato com o fundo cônico do tubo. Evite gerar bolhas. No final desta etapa, a mistura deve ser translúcida.
- Uma vez homogeneamente misturada, de modo a que a mistura fique translúcida, transferir a mistura para um tubo contendo 4 ml de meio DMEM a 37 °C e homogeneizar com uma pipeta de vidro pipetando para cima e para baixo.
- Semeadura celular
- Conte as células. O número de neurônios na solução pode ser contado de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão.
nota: Em experimentos de imagem para detecção de anticorpos e atividade de cálcio, uma concentração de 50.000 células por prato de 3,5 cm é ideal.
- Mantendo as células suspensas, retire o volume calculado e coloque em placas de 3,5 cm contendo lamínulas revestidas com PLL ou nas placas com fundo de vidro revestidas com PLL.
- Distribua uniformemente as células na louça agitando suavemente em movimentos cruzados (para frente e para trás, depois de um lado para o outro; repita conforme necessário) e coloque as louças na incubadora de CO2 (5%).
nota: É importante usar movimentos cruzados para evitar que as células se instalem na periferia do prato.
- A cada semana, adicione aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que a cultura não seque.
nota: Após 2 semanas (14 dias in vitro [div]), os neurônios estão maduros e expressam todos os fatores a serem usados para experimentação. O número médio total de neurônios obtidos usando este protocolo é de aproximadamente 2,5 x 106 neurônios provenientes de uma média de 12 embriões E18 por rata prenhe.
PARTE 2: Usando culturas neuronais do hipocampo para detecção de anticorpos em proteínas de superfície celular neuronal
NOTA: Esta parte do protocolo demonstra como as culturas do hipocampo são usadas para identificar anticorpos anti-NMDAR no soro e/ou LCR de pacientes com encefalite anti-NMDAR. A imunocoloração fluorescente é usada para visualizar a reatividade nos neurônios vivos, mas outros métodos de visualização também podem ser usados. Um controle apropriado para este experimento seria soro ou LCR de um indivíduo saudável. Ao usar amostras humanas, lembre-se de que pode ser necessária a aprovação do comitê de ética institucional.
3. Imunomarcação fluorescente viva
- Use células de 14 div que foram cultivadas em lamínulas (50.000 células por prato de 3,5 cm contendo cinco lamínulas).
- Dentro do exaustor, enxágue as lamínulas com NB pré-aquecido a 37 °C.
- Adicione a amostra que, neste caso, contém anticorpos anti-NMDAR (usados como anticorpo primário) diluídos em meio NB a 1:200 para soro ou 1:2 para LCR e incube 1 h a 37 °C (dentro da incubadora de CO2 (5%).
- Enxágue cuidadosamente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 3x em RT.
- Adicionar solução de fixação (formaldeído a 4% em PBS) e incubar em RT por 5 min.
cuidado: Ao manusear formaldeído a 4%, trabalhe dentro do capô e use o equipamento de proteção individual recomendado.
- Lave 3x com PBS por 5 min cada.
- Adicionar anticorpo secundário Goat anti-Human AF488 na diluição de 1:1000 e incubar em RT por 1 h.
nota: Durante a incubação, proteja da exposição à luz cobrindo com papel alumínio.
- Lave 3x com PBS por 5 min cada. Enxágüe com água destilada
- Monte as lamínulas com um meio de montagem líquido (por exemplo, mídia de montagem antidesbotamento com DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire qualquer líquido restante e enxágue com água destilada. Os neurônios agora estão prontos para imagens de fluorescência.
cuidado: Ao manusear o meio de montagem, use o equipamento de proteção individual recomendado.
