Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas em um capô BSL2, a menos que indicado de outra forma. A titulação viral é necessária antes de um ensaio de neutralização por redução de placa (PRN) para determinar a concentração ideal de VSR usada no ensaio PRN. Recomenda-se alíquota dos estoques de vírus em um pequeno volume que será descongelado uma vez e usado para cada ensaio de NAb. Recomenda-se também a utilização do mesmo stock viral para todos os ensaios de NAb realizados para todas as amostras de um estudo. Certifique-se de que os meios de cultura e a solução salina tamponada com fosfato (PBS) sejam aquecidos a 37 °C antes de adicioná-los às placas celulares.
1. Titulação viral do VSR
NOTA: Dependendo do número de estoques de vírus e do número de duplicatas, a placa de ensaio pode ser configurada de acordo com a Figura 1. Cada estoque de vírus deve ser titulado em triplicata na placa de ensaio, começando na concentração viral mais alta (ou seja, 1:10). As titulações seriadas podem ser tipicamente 1:10. Os procedimentos de cultura e manutenção de células A549 e cultura de VSR são feitos usando procedimentos padrão e não estão incluídos neste protocolo.
- Placas de semeadura (Dia 1)
- Ressuspenda as células A549 no meio Modified Eagles de Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal de bezerro (FCS) + 1000 UI de penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococos) a 4 x 105/mL. Semeie placas estéreis de fundo plano de 96 poços com 100 μL / poço contendo 4 x 104 células A459.
- Incubar as placas durante a noite a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) (as células estarão na fase logarítmica de crescimento).
nota: Utilizar um novo frasco para injetáveis de células A549 após 23 passagens. Recomenda-se não iniciar os experimentos quando um novo frasco de células ainda estiver nas três primeiras passagens.
- Infecção por vírus (dia 2)
- Preparação da diluição seriada do vírus
- Descongele rapidamente um único frasco congelado de vírus sincicial respiratório (VSR) em banho-maria a 37 °C até quase completamente descongelado e coloque imediatamente no gelo. Preparar 3 réplicas para cada reserva de vírus do VSR a analisar, utilizar uma diluição inicial da reserva de vírus de 1:10 com 100 μL de vírus/alvéolo diluído e reservar pelo menos uma coluna para controlo negativo.
NOTA: A Figura 1 mostra o controle negativo em triplicatas.
- Adicionar 100 μL de cada vírus diluído a 1:10 em triplicata da linha A de uma placa estéril de fundo em U de 96 poços. Adicionar 90 μL/alvéolo de DMEM + 1000 UI de caneta/estreptococo sem FCS às linhas B a H.
- Efectuar diluições de série 1:10 na placa, transferindo 10 μL da linha A para a linha B. Misturar a solução pipetando o conteúdo para cima e para baixo 5 vezes e continuar as diluições de dez vezes até à linha H. Rejeitar os 10 μL finais de modo a que o volume final em cada alvéolo seja de 90 μL.
NOTA: É importante usar novas pontas para cada diluição.
- Inoculação de vírus em células A549
- Recupere a(s) placa(s) de células A549 preparada(s) no dia anterior. Certifique-se de que as monocamadas de células A549 nas placas de 96 poços sejam ~80% confluentes. Descarte a mídia invertendo suavemente a placa e enxugando-a levemente em uma toalha de papel absorvente estéril.
- Lave todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes; descarte o excesso de PBS invertendo suavemente a placa e enxugando levemente em uma toalha de papel absorvente estéril após cada lavagem. Não deixe as placas secarem.
- Transferir as diluições do vírus da placa de titulação viral (figura 1) para os alvéolos correspondentes na placa celular A549. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2. Após 1 h de incubação, decantar os sobrenadantes utilizando uma pipeta (para evitar a contaminação cruzada). Retire 90 μL / poço.
- Adicione 100 μL de 1x meio 199 (M199, consulte a Tabela de Materiais) + 1,5% de sal de sódio carboximetilcelulose (CMC) de baixa viscosidade + 2% de FCS contendo caneta/estreptococo em cada poço.
NOTA: 2x M199 + 4% FCS + 2% caneta/estreptococo e 3% CMC devem ser preparadas e armazenadas a 4 °C para uso futuro. Certifique-se de que a solução esteja aquecida a 37 °C antes de adicionar às placas.
- Prepare 2x solução M199: 1 sachê/500 mL de água destilada + 20 mL de FCS + 10 mL de caneta/estreptococo (para perfazer 2x MI99). Filtrar a solução utilizando uma unidade filtrante de 0,22 μm.
- Para a preparação de CMC a 3%, adicione 15 g de CMC lentamente em 500 mL de água destilada. Dissolva o CMC em água usando um aquecedor agitador metálico a 50 °C, que leva cerca de 1 hora para ser preparado. Misture bem para fazer CMC a 3% e autoclave a solução.
NOTA: O sólido CMC deve ser adicionado à água a ser dissolvida; Adicionar água ao sólido seco produz um "aglomerado" de sólido que é muito difícil de dissolver.
- Prepare 1x M199 + 1.5% CMC de baixa viscosidade + 2% FCS contendo caneta/estreptococo misturando 1:1 o 2x M199 e 3% CMC preparado na etapa 1.2.2.4.2.
- Incubar a placa por 3 dias a 37 °C, 5% CO2.
- Desenvolvimento de placas de ensaio e análise (Dia 5)
- Placa de ensaio de fixação e revelação
- Descarte M199 + CMC + 2% FCS contendo caneta/estreptococo invertendo suavemente a placa. Adicione lentamente (para evitar perturbar a camada celular) 200 μL de tampão de fixação (80% de acetona, 20% de PBS, armazenado a -20 ° C) para fixar as células. Incubar a -20 °C durante 20 min.
- Descarte o tampão de fixação e seque-o suavemente em uma toalha de papel absorvente. Deixe o prato virado para baixo para secar por 10 minutos.
nota: A partir desta etapa, o ensaio pode ser realizado fora do capô BSL2.
- Prepare a solução de bloqueio do diluente de leite a 5% em PBS filtrado contendo 0,05% de polissorbato 20 (polissorbato PBS, consulte a Tabela de Materiais). Calcule o volume necessário para o bloqueio de uma placa com base em 200 / poço e 110 poços: 200 μL / poço x 110 poços = 22 mL (1,1 mL de diluente de leite concentrado em 20,9 mL de polissorbato PBS filtrado). Nesta fase, também constitua uma solução de bloqueio suficiente para anticorpos primários e secundários. Calcule o volume necessário para cada solução de anticorpos para uma placa com base em 50 μL/poço e 110 poços: 50 μL/poço x 110 poços = 5,5 mL. Portanto, o volume total de solução de bloqueio do diluente de leite necessário para um ensaio de placa única é de 33 mL.
- Adicione 200 μL/poço de solução de bloqueio. Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Descarte a solução invertendo suavemente a placa e seque em uma toalha de papel absorvente.
- Prepare o anticorpo 1:500 cabra X VSR (mAb – anticorpo primário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 μl/alvéolo da solução de mAb e incubar a 37 °C durante 1 h. Lave a placa 3 vezes com polissorbato PBS filtrado.
- Prepare Alexa-Fluor 1:5.000 Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (anticorpo secundário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 μl/alvéolo da solução de anticorpos secundários e incubar a 37 °C durante 1 h. Lave a placa 5 vezes com polissorbato PBS filtrado.
- Leia a placa em um leitor de ponto automatizado usando o canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e as configurações de contagem, conforme mostrado na Figura 2. Embrulhe a placa em papel alumínio e armazene-a a 4 °C. Calibre o instrumento usando uma placa de cultura de 96 poços não utilizada e insira as configurações de contagem antes do ensaio.
nota: É possível digitalizar novamente dentro de alguns dias, se necessário. A configuração de calibração e contagem pode ser salva e usada para varredura futura se o ensaio usar o mesmo tipo de placa usada para a calibração.
- Verifique as imagens dos poços em busca de placas de artefatos ou monocamadas celulares rompidas (Figura 3). Excluir poços com monocamadas de células interrompidas.
nota: Dependendo do tamanho das placas de artefato, contagens manuais podem precisar ser realizadas para esses poços, ou esses poços podem precisar ser descartados da análise de dados. Os critérios para um resultado válido incluem nenhuma monocamada celular rompida ou placas de artefato detectadas em mais de um poço replicado e nenhuma unidade formadora de placa (PFU) detectada em poços negativos (poços sem adição de vírus).
- Determinar concentrações virais
- Escolha as duas últimas diluições onde as manchas podem ser contadas claramente. Calcular o número médio de manchas de poços replicados com a mesma diluição. Calcule o título viral (PFU por mL) da amostra de estoque usando a fórmula abaixo:
PFU/mL = Número médio de placas/(Fator de diluição × Volume de vírus diluído adicionado ao poço)
nota: A concentração de vírus determinada para cada estoque de VSR agora pode ser usada no ensaio PRN (etapa 2).
2. Ensaio de neutralização do VSR
- Placas de semeadura (Dia 1)
- Ressuspenda as células A549 em DMEM + 10% FCS + 1000 UI de caneta/estreptococo a 4 x 105/mL. Semear placas estéreis de fundo plano de 96 poços com 100 μL/poço contendo 4 x 104 células A459 e incubar placas durante a noite a 37 °C, 5% de CO2 (as células estarão na fase logarítmica de crescimento).
nota: Utilizar um novo frasco para injetáveis de células A549 após 23 passagens. Não é recomendado usar células A549 antes da passagem número 3.
- Preparação de vírus e soro (Dia 2)
nota: Dependendo do tipo de amostra, existem etapas necessárias para o pré-processamento de amostras antes do ensaio NAb. Recomenda-se o uso do soro padrão internacional RSV que agora está disponível mediante solicitação do Instituto Nacional de Padrões e Controles Biológicos (NIBSC).
- Preparação da diluição do soro
- Descongelar o anti-soro de referência do VSR humano (soro de referência, REF) e as amostras de teste de soro em RT. Amostras de soro inativadas pelo calor e anti-soro de referência em banho-maria a 56 °C por 30 min antes de usar. Prepare as diluições de acordo com o modelo da placa (Figura 4).
- Prepare uma diluição de 1:100 do REF. Prepare um mínimo de 110 μL de REF diluído em DMEM + caneta / estreptococo sem FCS por placa de ensaio (por exemplo, 1,5 μL de REF em um volume total de 150 μL). Adicione 110 μL de REF diluído a 1:100 no poço A12 de uma placa estéril de fundo em U de 96 poços.
- Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococos sem FCS aos alvéolos B12 a H12 na coluna 12. Efectuar diluições de série 1:2 na placa, transferindo 55 μL da linha A para a linha B, misturando a solução pipetando o conteúdo para cima e para baixo 5 vezes e continuando até à linha H. Rejeitar os 55 μL finais de meio de modo a que o volume final em cada alvéolo seja de 55 μL. Utilizar novas pontas para cada diluição.
- Preparar a diluição a 1:100 das amostras de soro. Como todas as amostras de soro são analisadas em triplicata, prepare um volume mínimo de 110 μL / poço x 3 = 330 μL por amostra de teste de soro.
- Adicione 110 μL de cada amostra de teste de soro diluído (1:100; S1 = soro 1, S2 = soro 2, etc.) aos poços correspondentes A1 a A9 e também E1 a E9 da placa estéril de 96 poços conforme Figura 4.
- Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS a todos os poços rotulados como X. Execute diluições seriais 1:2 de acordo com a etapa 2.2.1.3 até a linha D (para as amostras 1, 2 e 3). Descarte os 55 μL finais de meio de modo que o volume final em cada poço seja de 55 μL. Da mesma forma, execute as diluições seriais 1:2 para as amostras 4, 5 e 6 para as linhas E a H.
nota: É essencial usar novas pontas para cada diluição.
- Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS aos alvéolos das colunas 10 e 11.
- Preparação do vírus
- Descongelar rapidamente um único frasco congelado de RSV em banho-maria a 37 °C até quase completamente descongelar e colocar imediatamente sobre gelo.
- Diluir o vírus em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS com base na concentração da alíquota do VSR determinada no passo 1.3.2. Aplique uma diluição que dê aproximadamente 200 PFU/poço. Prepare um volume total de 5,5 mL (para 100 poços).
- Preparação da mistura vírus-soro
- Adicionar 55 μl do vírus diluído a todos os alvéolos das colunas 1-9 e aos alvéolos das linhas E-H das colunas 10 e 11 (controlo positivo) de acordo com o gabarito da placa (figura 4).
- Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS a todos os alvéolos das linhas A-D das colunas 10 e 11 (controlo negativo). Incubar a placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Inoculação de vírus em células A549
- Antes de completar o período de incubação, recupere a(s) placa(s) de células A549 preparada(s) na etapa 2.1.1. Certifique-se de que as monocamadas de células A549 nas placas de 96 poços sejam ~80% confluentes.
- Descarte a mídia invertendo suavemente a placa e enxugando-a levemente em uma toalha de papel absorvente estéril. Lave todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso de PBS invertendo suavemente a placa e enxugando levemente em uma toalha de papel absorvente estéril após cada lavagem. Não deixe as placas secarem.
- Transferir 100 μL/alvéolo da mistura vírus-soro para os alvéolos correspondentes na placa celular A549 seguindo o modelo da placa. Incubar a placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Após 1 h, usando uma pipeta, retire 90 μL / poço e adicione 100 μL de 1x M199 pré-aquecido + 1,5% CMC + 2% FCS + caneta / estreptococo. Incubar a placa por 3 dias a 37 °C, 5% CO2.
nota: Certifique-se de que a solução seja aquecida a 37 °C antes de adicionar às placas.
- Desenvolvimento de placas de ensaio e análise (Dia 5)
- Desenvolver a placa de fixação e de ensaio seguindo os passos 1.3.1.1 a 1.3.1.8.
- Determine o título de neutralização de 50%
- Determinar o título de neutralização de 50% calculando a distância proporcional entre as diluições recíprocas do soro acima e abaixo de 50% dos alvéolos de controlo «sem soro» (controlo positivo do vírus - coluna 10, linhas E-H).
- Conte o número de PFU (ou seja, placas) decorrentes de infecções virais individuais em poços de soro e nenhum poço de controle de soro. Calcule o número médio de PFU dos alvéolos de controle sem soro e determine o valor de 50%.
- Identificar as diluições de soro com contagens imediatamente superiores e inferiores ao valor de 50% dos alvéolos de controlo sem soro. Usando um gráfico semi-log ou modelo de planilha, plote o número de PFU no eixo x (escala linear) e a diluição sérica recíproca no eixo y (escala log10). Desenhe uma linha entre os dois pontos e leia os títulos de neutralização de 50% das amostras de soro de teste desta linha.
