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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação do buffer
- Tampão de rotulagem (2x solução salina tamponada com fosfato, (PBS), pH 7,9): Em 400 mL de água destilada deionizada (DD), adicione 100 mL de 10x PBS, ajuste o pH para 7,9 com hidróxido de sódio (NaOH).
- 3 mM de biotina: Dissolva 1 mg de biotina em 588 μL de tampão de marcação.
- 3 mM de Sulfo-tag: Dissolver 150 nmol de Sulfo-tag em 50 μL de tampão de rotulagem.
- Tampão antígeno (5% BSA): Em 500 mL de 1x PBS, adicione 25 g de albumina de soro bovino (BSA).
- Prepare a solução de ácido acético 0,5 M.
- 1,0 M de tampão Tris-HCl pH 9,0: Prepare o tampão Tris-HCl 1 M e ajuste o pH para 9,0 com HCl.
- Tampão de revestimento (3% Bloqueador A): Em 500 mL de 1x PBS, adicione 15 g de Bloqueador A.
- Tampão de lavagem (0,05% Tween 20, PBST): Em 5000 mL de 1x PBS, adicione 2,5 mL de Tween 20.
- Tampão de leitura (2x Read Buffer T com surfactante): Em 500 mL de água DD, adicione 500 mL de 4x Read Buffer T com surfactante (Tabela de Materiais).
- Armazenar a biotina e o Sulfo-tag em um freezer a -20 °C.
nota: As soluções de biotina e sulfo-tag devem sempre ser preparadas imediatamente antes do procedimento de rotulagem.
2. Rotular o autoantígeno das ilhotas humanas com biotina e sulfo-tag
NOTA: Uma alta concentração de antígeno, ≥0,5 mg/mL, é recomendada para uma reação de marcação mais eficiente.
- Determine a razão molar do autoantígeno das ilhotas humanas para biotina e sulfo-tag.
- Obter o número molar do antigénio dividindo o peso do antigénio pelo peso molecular.
- Use a razão molar de 1:5 para o antígeno com menor peso molecular (≤10 kd) e a razão molar de 1:20 para o antígeno com maior peso molecular (>50 kd).
- Calcular o volume de biotina ou sulfo-tag dividindo o número molar pela sua concentração.
- Misture o autoantígeno de ilhotas humanas com biotina ou sulfo-tag com a proporção molar de 1:5.
nota: A proteína em sistemas tampão tris ou glicina deve ser trocada por tampão PBS 2x com pH 7,9 usando a coluna de rotação de dimensionamento.
- Como a biotina e o sulfo-tag são sensíveis à luz, cubra os tubos de reação com papel alumínio. Incubar a reação à temperatura ambiente (RT) por 1 h.
- Durante a incubação, prepare a coluna de centrifugação dispensando 2x tampão PBS na coluna três vezes. Centrifugue a solução a 1000 x g por 2 min de cada vez.
nota: Atualmente, a reação de rotulagem, por meio de pontes, ainda está ocorrendo e precisa ser interrompida.
- Pare a reação de marcação purificando o autoantígeno de ilhotas humanas marcado. Para purificar, passe o autoantígeno pela coluna de centrifugação e centrifugue a coluna a 1000 x g por 2 min.
- Determinar a concentração de antigénio marcada (μg/μL) utilizando a quantidade de proteína do antigénio e o volume final.
nota: Aproximadamente, haverá 90 - 95% de retenção do antígeno marcado após cada passagem da coluna de rotação.
- Alíquota do antígeno marcado e armazene o antígeno marcado a -80 °C.
3. Defina as melhores concentrações e proporções para os dois antígenos marcados para o ensaio (Checker Board Assay)
- Prepare duas amostras de soro, uma alta positiva e outra negativa, com um volume total de 200 μL para cada uma.
- Alíquota de 4 μL de soro e adicione 1x PBS até que o volume final seja de 20 μL por poço para uma placa de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 96 poços. Use metade de uma placa para a amostra positiva alta e a outra metade para a amostra negativa, conforme mostrado na Figura 1A.
- Adicione 10 μL de biotina e 10 μL de antígeno marcado com Sulfo-tag e conduza diluições seriais para os dois antígenos marcados de forma diferente, conforme mostrado na Figura 1A. Execute uma diluição serial horizontal para um antígeno marcado e uma diluição serial vertical para o outro antígeno marcado.
- Continuar os restantes passos do ensaio descritos nos pontos 5.3 a 9.1.
- Calcule a proporção de sinais da amostra positiva alta em relação a cada um dos sinais correspondentes da amostra negativa mostrada na Figura 1B.
- Identifique as melhores concentrações para antígenos marcados com biotina e sulfo-tag, selecionando um ponto com a proporção mais alta ou quase mais alta de positivo para negativo. Considere o sinal de fundo baixo da amostra negativa para identificar a proporção.
nota: O Dia 1 do Ensaio inclui a Etapa 4 à Etapa 6.
4. Preparar o tampão antigénio utilizando a concentração correcta de antigénio marcado com biotina/sulfo-tag
- Selecione a concentração racional de cada antígeno com base no ensaio da placa de verificação.
- Prepare 3 mL de solução de antígeno por placa, usando a concentração racional de antígeno marcado com biotina/sulfo para o tampão de antígeno.
5. Incubar amostras de soro com antígeno marcado
NOTA: Existem dois protocolos nesta seção, um sem tratamento com ácido sérico e outro com tratamento com ácido sérico. Todos os ensaios de autoanticorpos de ilhotas, exceto o ensaio de autoanticorpos de insulina (IAA), usam protocolo regular sem tratamento com ácido sérico das etapas 5.1 a 5.5, enquanto o ensaio de IAA ignora essas etapas e usa protocolo com tratamento com ácido sérico das etapas 5.6 a 5.9.
- Alíquota de 4 μL de soro e adicione 1x PBS até que o volume final seja de 20 μL por poço para uma placa de PCR de 96 poços.
- Adicione 20 μL de solução de antígeno marcada por poço.
- Cubra a placa PCR com folha de vedação para evitar a luz.
- Coloque o prato em uma coqueteleira (velocidade baixa) em RT por 2 h.
- Coloque a placa no frigorífico a 4 °C e incube durante a noite (18 - 24 h).
nota: O seguinte protocolo de etapas de 5.6 a 5.9 foi projetado apenas para o ensaio IAA e outros ensaios de autoanticorpos pulam essas etapas.
- Misture 15 μL de soro com 18 μL de ácido acético 0,5 M para cada amostra de soro. Incube esta mistura em RT por 45 min.
- Preparar a solução de antigénio com a concentração racional de biotina e antigénio marcado com Sulfo-tag, com base no ensaio da placa de verificação, utilizando tampão antigénio. Em cada poço, alíquota de 35 μL de tampão antígeno, contendo biotina e antígeno marcado com sulfo-tag, em uma nova placa de PCR.
- Antes de terminar o passo de incubação de 45 min (passo 5.6), adicionar 8,3 μL de tampão 1 M Tris pH 9,0 ao lado de cada alvéolo na placa de antigénio (passo 5.6). É importante limitar a mistura entre o tampão Tris e o antígeno. Transfira imediatamente 25 μL do soro, que é tratado com ácido, na etapa 5.6, para cada poço e agite a solução. Cubra a placa PCR com folha de vedação para evitar a luz.
- Coloque a placa num shaker (velocidade baixa) a RT durante 2 h. Coloque a placa no frigorífico a 4 °C e deixe a placa incubar durante a noite (18 - 24 h).
6. Prepare a placa de estreptavidina
- Retirar uma placa de estreptavidina do frigorífico a 4 °C e deixar a placa entrar em RT.
- Quando a placa de estreptavidina estiver em RT, adicione 150 μL de bloqueador A a 3% a cada poço.
- Cubra a placa de PCR com papel alumínio.
- Incubar a placa no frigorífico a 4 °C durante a noite.
NOTA: O dia 2 do ensaio inclui a Etapa 7 à Etapa 9.
7. Transfira o soro/antígeno incubado para a placa de estreptavidina
- No dia seguinte, retire a placa de estreptavidina da geladeira e descarte o tampão da placa. Coloque algumas toalhas de papel secas sobre a mesa e bata no prato de cabeça para baixo até que não haja mais tampão dentro dos poços.
- Encher a placa de estreptavidina vazia com 150 μl de PBST por alvéolo e eliminar a PBST da placa durante um total de três lavagens.
- Transfira 30 μL de incubação de soro/antígeno por poço para a placa de estreptavidina.
- Cubra o prato com papel alumínio para evitar a luz. Agite a placa, em uma configuração baixa, em RT por 1 h.
8. Lave a placa e adicione buffer de leitura
- Descarte as incubadoras do prato. Adicione 150 μL de PBST por alvéolo e descarte o PBST da placa para um total de três lavagens.
- Após a lavagem, adicione 150 μL por poço de tampão de leitura.
nota: É importante evitar bolhas de ar na solução, pois isso afetará a forma como a placa é lida na máquina de leitura de placas.
