1. Enxertia de grupos funcionais de amina em discos de papel de celulose
- Prepare um pedaço de papel quadrado com uma dimensão de 1 cm × 1 cm e 100 discos de papel feitos de papel de celulose grau nº 1 com um diâmetro de 6.0 mm (papel de filtro de fluxo médio) usando um furador.
- Para derivar os grupos -NH2 nos discos de papel, misturar 1 ml de 3-aminopropiltrimetoxissilano (APS) e 10 ml de acetona num frasco de vidro de 50 ml na hotte. Adicione discos de papel à mistura de reagentes APS recém-preparada e incube por 5 horas com agitação orbital (200 rpm) à temperatura ambiente.
cuidado: Manuseie APS e acetona na hotte.
- Transvase o excesso de solução do frasco de vidro de 50 ml para um recipiente de resíduos orgânicos.
- Adicione 10 ml de acetona ao frasco de vidro, misture bem e transvase completamente para remover qualquer APS não reagido e outras impurezas. Repita esta etapa duas vezes.
- Espalhe os discos de papel sobre a toalha de papel e leve ao forno a 110 °C por 3 horas. Deixe os discos de papel esfriarem. Armazenar os discos num tubo de centrifugação de 50 ml à temperatura ambiente.
- Use espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) para verificar o enxerto de grupos amina no papel quadrado de celulose, conforme descrito abaixo (Figura 1A).
- Ligue o computador e abra o instrumento de espectroscopia FTIR.
- Abra o software para espectroscopia FTIR.
- Vá para 'Medição → Inicializar'. Os retângulos para 'BS: KBr', 'Lamp: Infrared' e 'Laser' ficarão verdes quando a inicialização for concluída.
- Escolha 'Dados' abaixo dos retângulos e selecione '% Transmitância', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' e 'Min: 400, Max: 4000' para 'Modo de medição', 'Apodização', 'Nº de varreduras', 'Resolução' e 'Intervalo (cm-1)'.
- Clique em 'Medir'.
- Selecione 'Arquivo de dados' para os dados de fundo. Anote os comentários.
- Clique em 'BKG' para obter a linha de base do plano de fundo.
- Fixe o papel quadrado no suporte de amostra de filme.
- Selecione 'Arquivo de dados' para os dados de amostra. Anote os comentários.
- Clique em 'Amostra' para obter os espectros da amostra.
- Feche o aplicativo de espectroscopia FTIR e desligue o computador.
- Repita as etapas acima (etapas 1.1 a 1.6) para preparar papel quadrado de celulose de grau nº 113 funcionalizado com amina e discos (papel de filtro de fluxo rápido) e obter os espectros FTIR para o papel quadrado de grau nº 113 (Figura 1B).
2. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) baseado em papel para detecção de imunoglobulina G (IgG)
- Adicione 5 ml de solução de glutaraldeído a 0,05% (preparada em tampão PBS 50 mM, pH 7,4) a um frasco de vidro de 20 ml. Mergulhe 15 discos de papel de filtro de fluxo médio funcionalizados com amina nesta solução e mantenha por 1 hora agitando à temperatura ambiente.
- Ao mesmo tempo, repita a Etapa 2.1 para preparar outros 15 discos de papel de filtro de fluxo rápido funcionalizados com aldeído.
cuidado: Manuseie o glutaraldeído na hotte.
- Para remover o glutaraldeído não reagido dos discos de papel, coloque os 15 discos de papel de filtro de fluxo médio em um tubo de centrífuga de 15 ml e os 15 discos de papel de filtro de fluxo rápido em outro tubo de centrífuga de 15 ml. Adicione 5 ml de água DI a cada tubo e agite os tubos por 10 segundos. Remova a água aspirando com uma pipeta. Repita duas vezes para remover qualquer glutaraldeído que não tenha reagido.
- Seque os discos de papel em um forno a 37 °C.
- Adicione 5 μl e 8 μl de 0,025 mg/ml de anticorpos de fragmento IgG-Fc de camundongo a cada um dos discos de papel de filtro de fluxo médio e rápido, respectivamente, e incube por 20 min.
- Adicione 10 μl de PBS 50 mM (pH 7,4) a cada disco de papel sem remover os anticorpos e incube por 40 min para a reação amina-aldeído.
- Lave os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem em cima de uma toalha de papel. Repita a lavagem três vezes.
- Seque os discos de papel em uma estufa a 37 °C.
- Bloqueie os discos de papel com 15 μl de tampão de bloqueio por 10 min em temperatura ambiente.
- Lave cada disco de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem em cima de uma toalha de papel. Repita a lavagem três vezes.
- Execute os padrões IgG.
- Carregue 10 μl de várias concentrações de IgG (por exemplo, 0, 10, 125, 250 e 500 ng/ml em PBS) em cada disco em triplicata. Incube por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lave os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem em cima de uma toalha de papel. Repita a lavagem três vezes.
- Carregue 10 μl de anticorpos de fragmento IgG-Fc de camundongo conjugados com HRP (1:10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lave os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem em cima de uma toalha de papel. Repita a lavagem três vezes.
nota: Não é necessário remover o tampão de lavagem, pois os resultados não são afetados pela presença de tampão.
- Carregar uma mistura de 10 μl de TMB e peróxido de hidrogénio em cada disco.
- Tire imagens de todos os discos de papel com uma câmera digital ou smartphone após 5 min de incubação.
nota: Na Figura 2A, '0' significa discos de papel tratados com imobilização de anticorpos de captura e a solução de anticorpo-HRP/TMB sem soro de IgG.
- Analise a intensidade de cada disco de papel na imagem pela Imagem J.
- Converta as imagens tiradas na etapa 3.15 para o formato '.tif'.
- Abra o software 'Image J'.
- Vá para 'Arquivo → Abrir', escolha a imagem a ser analisada.
- Escolha o botão de forma 'Oval'.
- Vá para 'Tipo de → de imagem → 32 bits'.
- Vá para 'Editar → inverter'.
- Vá para 'Analisar → Medir'.
- Copie e analise os dados em uma planilha.
