1. Formação de biofilme de C. tropicalis
- Prepare biofilmes de Candida em uma placa de microtitulação de poliestireno de fundo plano de 96 poços, conforme descrito anteriormente (Figura 1).
- Adicione 100 μL de cultura de C. tropicalis (de 10 6 células/mL de estoque, preparado como acima) a uma placa de microtitulação de 96 poços usando uma pipeta multicanal (Figura 2A). Manter as duas últimas colunas (11 e 12) como controlos negativos «sem fungos mais soro» e «sem fungos e sem soro», não adicionando células fúngicas. Preencha as colunas 11 e 12 com 100 μL de meio de ácido morfolinossulfônico (MOPS) 1640 do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sozinho.
- Cubra a placa de microtitulação com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C em condições estacionárias.
- No dia seguinte, aspire o meio cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou interromper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de mata-borrão para remover qualquer meio residual.
- Lave a placa com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) (por poço) usando uma pipeta multicanal. Adicione PBS muito suavemente ao longo das paredes laterais do poço para evitar a interrupção dos biofilmes. Aspire o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal. Repita a lavagem PBS 2x (um total de três lavagens).
- Para remover o excesso de PBS, seque a placa ao ar (sem a tampa) por 30 min em temperatura ambiente, dentro de uma cabine de segurança biológica.
2. Tratamento do biofilme com anticorpos
NOTA: Os biofilmes agora podem ser processados para avaliar a inibição da maturação do biofilme por anticorpos. O soro murino foi usado como fonte de anticorpos policlonais. Diferentes grupos de camundongos imunizados com Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis e Sap2-parapsilosis), juntamente com camundongos imunizados com simulação, foram sangrados retroorbitalmente e o soro foi isolado. A presença de anticorpos anti-Sap2 foi confirmada usando o ensaio imunoenzimático específico para Sap2 (ELISA).
- Realize a inativação térmica do soro (fonte de anticorpos policlonais) a 56 ° C por 30 min antes do uso para descartar o papel do complemento na atividade inibitória. Inative o soro por calor antes de fazer a diluição do soro.
nota: Use soro de camundongos imunizados simulados, camundongos pré-imunes e soro depletado de anticorpos específicos para Sap2 como controles adicionais. O soro depletado de anticorpos foi preparado de acordo com um estudo anterior. Entre as diluições seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 e 1:12.800) para o soro testado neste protocolo, a inibição da maturação do biofilme foi observada em 1:25, 1:50 e 1:100; portanto, 1:50 foi selecionado para encontrar um equilíbrio entre inibição e consumo de soro.
- Preparar diluições seriadas de amostras de soro inactivadas pelo calor em meio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilizar uma diluição de soro comum (1:50) para todas as amostras de soro a serem analisadas quanto à inibição da maturação do biofilme.
- Adicione 100 μL da diluição de soro selecionada a cada poço da placa de microtitulação de 96 poços. Para cada amostra, adicionar diluições de soro em duplicado, de acordo com o esquema em anexo (figura 2B).
- Na coluna 10, não adicionar diluição de soro; adicionar apenas o meio RPMI 1640 MOPS para o controlo positivo apenas para fungos.
nota: A coluna 10, linhas G1-G8 e H1-H8 inicialmente tinha células fúngicas em RPMI-MOPS. No entanto, enquanto o RPMI-MOPS foi adicionado à coluna 10 mesmo após 24 h, as linhas G1-G8 serviram como controle PBS e as linhas H1-H8 como controle sem soro após 24 h.
- Na coluna 11, adicionar uma diluição de 1:50 de soro a todos os alvéolos para servir de controlo negativo sem fungos e soro.
- Na coluna 12, não adicione diluição de soro a nenhum poço; mantenha-o como o controle negativo sem fungo e sem soro.
- Cubra o prato com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C.
3. Estimativa da atividade metabólica do biofilme
- No dia seguinte, aspire o soro cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou romper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de mata-borrão para remover qualquer soro residual.
- Lave a placa com 200 μL de 1x PBS (por poço) usando uma pipeta multicanal, adicionando o PBS ao longo das paredes laterais do poço para evitar a ruptura dos biofilmes. Aspire o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal e repita a lavagem do PBS 2x (um total de três lavagens). Seque a placa ao ar (sem a tampa) por 30 min em temperatura ambiente, dentro de um armário de segurança biológica para secar qualquer excesso de PBS.
- Preparação de XTT(2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida)/menadiona:
- Prepare XTT em Ringers Lactato estéril como uma solução de 0,5 g / L. Dissolva 25 mg de XTT em 50 mL de Ringer Lactato esterilizado por filtro. Alíquota 10 mL em tubos separados cobertos com papel alumínio e armazenar a -80 °C.
- Prepare o menadiona como um estoque de 10 mM. Dissolva 8,6 mg de menadiona em 5 mL de acetona e distribua 50 μL em 100 microtubos separados. Armazenar as alíquotas a -80 °C.
- Prepare a solução de XTT / menadiona imediatamente antes de usar, tomando 10 mL de XTT e adicionando 1 μL de menadiona para obter uma solução de trabalho de 1 μM.
- Adicionar 100 μL da solução de XTT/menadiona por alvéolo da placa de microtitulação de 96 poços. Cubra o prato com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 2 h a 37 °C na escuridão.
- Transfira 80 μL do sobrenadante colorido de cada poço para uma nova placa de 96 poços. Ler a placa a 490 nm.
- Calcular a média dos valores de absorbância dos poços na coluna 10 (controle positivo somente do fungo), que servirá de valor de referência para o cálculo da porcentagem de inibição do biofilme por cada amostra de soro usando a equação (1).
% Inibição do biofilme = 100 - 
× 100 (1)
