Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparativos
- Prepare 10 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS): 32,27 g de hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4·12H2O), 4,5 g de di-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4·2H2O), 80,0 g de cloreto de sódio (NaCl) adicionado à água ultrapura até um volume final de 10 L. Armazene a solução em temperatura ambiente (RT).
- Preparar 200 ml de PBS-T: 200 ml de PBS desde o passo 1.1 com 100 μL de éter octilfenílico de polioxietileno (10) até uma concentração final de 0,05% (vol: vol). Armazene na RT.
- Enquanto estiver usando luvas e proteção para os olhos, prepare 50 mL de sacarose a 15% em solução de formalina neutra tamponada a 10%: 7,5 g de sacarose adicionada à solução de formalina neutra tamponada a 10% (Tabela de Materiais) até um volume final de 50 mL. Loja em RT.
cuidado: A inalação e/ou o contato da pele/olhos com formaldeído em solução de formalina neutra tamponada a 10% podem ser perigosos. Manuseie com cuidado.
- Prepare 1,5 mL de 200 unidades / mL de solução estoque de conjugado de corante faloidina-fluorescente: conjugado de corante faloidina-fluorescente (300 unidades em 1 frasco, sólidos liofilizados, excitação e comprimentos de onda de emissão: 581 nm e 609 nm, respectivamente) suspenso em 1,5 mL de metanol. Conservar a solução à escura a -20 °C.
- Preparar 5 mg/ml de solução-mãe de dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI): 10 mg de DAPI em 2 ml de N-dimetilformamida (DMF). Conservar a solução à escura a -20 °C.
- Prepare albumina de soro bovino (BSA) a 5% em PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Conservar a 4 °C.
- Remova a ponta chanfrada de uma agulha reta de calibre 18 usando uma pinça e aperte a extremidade cortada com uma pinça no sentido longitudinal para permitir que o líquido flua através do lúmen da agulha (Figura 1A1).
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Dissecção de animais e isolamento do jejuno
- Fixação de perfusão de um camundongo
- Use luvas e trabalhe em uma área bem ventilada.
- Prepare um copo de vidro de 100 mL, solução de formalina neutra tamponada a 10%, ferramentas cirúrgicas (tesoura, fórceps), uma bandeja metálica, suturas cortadas de náilon 6-0, uma agulha reta de calibre 18 preparada como em 1.7, uma agulha alada de calibre 22, uma seringa de 20 mL.
- Carregue 20 mL de solução de formalina neutra tamponada a 10% do copo de vidro para a seringa de 20 mL e conecte a agulha alada de calibre 22 à saída.
- Prepare a gelatina líquida adicionando 1 g de gelatina em pó a 20 mL de PBS (gelatina final de 5%) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Após imersão em RT por 15 min, incubar a 50 °C em banho-maria por 15 min sem agitar.
- Um breve vórtice e incube a 50 °C por mais 15 minutos para dissolver completamente a gelatina. Deixe o tubo em RT até o uso.
- Eutanásia de um camundongo adulto por luxação cervical.
- Coloque o mouse da etapa 2.1.6 em uma bandeja metálica e faça uma pequena incisão na pele através da cartilagem ensiforme usando ferramentas cirúrgicas.
- Expanda a incisão com as duas mãos para expor as regiões torácica e abdominal.
- Abra o peritônio para expor o diafragma e, em seguida, abra o diafragma em ambos os lados.
- Corte a caixa torácica ao longo das linhas axilares anteriores em ambos os lados e, em seguida, remova a parede torácica cortando na direção transversal na posição do timo para expor o coração.
- Faça uma pequena incisão na aurícula do átrio direito para drenar o sangue e insira uma agulha alada de calibre 22 no ápice do ventrículo esquerdo. Empurre o êmbolo para perfundir os tecidos com uma solução de formalina neutra tamponada a 10%.
- Depois de expor os órgãos da pelve, corte a extremidade do reto do ânus e separe os intestinos do corpo cortando o mesentério.
- Para isolar o jejuno, corte os intestinos a 4 cm do lado anal do antro gástrico. Descarte a metade anal do intestino delgado restante.
- Corte o jejuno ao meio para facilitar o procedimento de lavagem. Carregue 20 mL de solução de formalina neutra tamponada a 10% na seringa de 20 mL e conecte a agulha reta de calibre 18 preparada na etapa 1.7 na saída.
- Injete solução de formalina neutra tamponada a 10% de uma extremidade do jejuno cortado para limpar o conteúdo intestinal e fixar a superfície do lúmen intestinal ( Figura 1A2 ).
- Lave o lúmen intestinal injetando PBS conforme descrito na etapa 2.1.15.
- Lave a gelatina líquida no lúmen intestinal conforme descrito na etapa 2.1.15 para substituir o PBS por gelatina líquida.
- Feche uma extremidade do jejuno cortado por ligadura de sutura usando uma sutura de corte de náilon 6-0, encha o jejuno com gelatina líquida e feche a extremidade oposta por ligadura de sutura (Figura 1A3).
- Adicione quatro nós de sutura para encaixar uma seção de jejuno em forma de salsicha na porção deprimida de um criomold (Figura 1A4).
nota: Para criomoldes com uma seção deprimida de 20 mm x 25 mm x 5 mm, uma seção de jejuno semelhante a uma salsicha de ~ 20 mm é preferível.
- Mergulhe os tecidos em 50 mL de sacarose a 15% em solução de formalina neutra tamponada a 10% durante a noite a 4 ° C.
nota: Essas etapas garantem a crioproteção por sacarose e a fixação de proteínas por formalina da gelatina e do tecido. A gelatina gelatinizada com formalina não derrete em RT, enquanto a gelatina gelatinizada não fixa a 4 °C derrete em RT.
3. Congelamento instantâneo de tecidos de jejuno preenchidos com gelatina
- Cortando-se o jejuno nos nós de sutura, obtêm-se três pedaços de jejuno em forma de salsicha com ambas as extremidades ligadas (Figura 1A4). Alinhe os pedaços semelhantes a salsichas em um criomoldor para a adição de composto de incorporação para a preparação de amostras de tecido congelado.
- Congele o criomoldor em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Armazene os criomoldes a -80 °C
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Imunofluorescência de células de tufo usando criosseções flutuantes
- Crioseccionamento
- Defina a temperatura da câmara do criostato (CT) e a temperatura do objeto (OT) para -22 °C. Coloque o bloco de tecido congelado em um criomold na câmara do criostato por pelo menos 15 min.
- Adicione 3 mL de PBS a uma placa de cultura de 35 mm.
- Remova o bloco de tecido congelado do criomold e corte o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno. Monte metade do bloco em um mandril (um adaptador de criostato) para seccionar o plano de corte com a lâmina de barbear.
- Corte o jejuno cheio de gelatina em seções de 30 μm de espessura. Use uma pinça congelada para transferir suavemente as seções para a placa de cultura de 35 mm preparada na etapa 4.1.2 (Figura 2B, à direita).
- Aplicação de anticorpos primários
- Lave as seções flutuantes na placa de cultura de 35 mm 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T com agitação leve em um agitador recíproco (aproximadamente 36 vezes / min).
- Prepare a solução de recuperação de antígeno: 0,3 mL de concentrado de solução de recuperação de antígeno (Tabela de Materiais) em 2,7 mL de água ultrapura. Adicionar 3 ml de solução de recuperação de antigénios à placa de cultura de 35 mm que contém as secções flutuantes.
- Feche a tampa, feche o espaço entre o prato e a tampa com uma tira de fita adesiva e incube a 50 °C em uma incubadora de hibridização por 3 h sem agitar.
- Retire o prato da incubadora e deixe esfriar em RT por 20 min. Após remover a fita de vinil, lave as seções 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação leve.
- Aspire o PBS-T e adicione 5 gotas de solução de bloqueio (Tabela de Materiais) nas seções. Incubar em RT por 5 min com agitação leve.
- Prepare a solução de anticorpo primário: 495 μL de BSA a 5% em PBS com 5 μL de anticorpos fosfo-Y1798 girdina (pY1798) (Tabela de Materiais). Adicione 500 μL de solução primária de anticorpos nas seções (a solução de bloqueio não precisa ser removida).
- Colocar a cápsula numa câmara de incubação humidificada e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave.
nota: A incubação noturna pode ser estendida para até três noites.
- Aplicação de anticorpos secundários
- Lave as seções 3 vezes por 5 min cada em 3 mL de PBS-T com agitação suave.
- Preparar a solução-mãe DAPI diluída: 2 μL de solução-mãe DAPI (Etapa 1.5), 998 μL de PBS.
- Faça a solução de anticorpo secundário: 476 μL de BSA a 5% em PBS, 10,5 μL de solução DAPI diluída, 12,5 μL de solução estoque de conjugado de corante fluorescente de faloidina, 1 μL de conjugado de corante fluorescente IgG anti-coelho de cabra (comprimento de onda: excitação 496 nm, emissão 520 nm).
- Após aspirar o PBS-T, aplique a solução de anticorpos secundários e incube em uma câmara de incubação blindada contra luz em RT por 30 min com agitação leve.
- Lave as seções 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação leve.
- Após a lavagem final, remova o PBS-T e substitua-o por 3 mL de PBS sem éter polioxietileno (10) octilfenílico. Transfira a placa para um microscópio estereoscópico.
- Coloque 200 μL de PBS em uma gota no centro de uma lâmina de vidro branco revestida com MAS e transfira uma seção do jejuno do prato para a gota usando uma ponta de pipeta P200.
- Depois de ajustar o alinhamento da seção sob o microscópio estereoscópico, aspire todo o PBS restante ao redor da seção.
- Adicione 20 μL de meio de montagem aquoso e coloque uma lamínula de 20 x 20 mm sobre o meio.
- Vede imediatamente as bordas da lamínula com mídia de montagem à base de xileno. Coloque a lâmina em um mappe de madeira e deixe a mídia de montagem à base de xileno solidificar em RT por 2 a 3 h.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Depois que a mídia de montagem à base de xileno se solidifica, as lâminas podem ser armazenadas por 2 a 3 semanas em uma caixa de lâminas blindada contra luz em RT.
5. Microscopia Confocal
- Coloque óleo de imersão na objetiva 63X de um microscópio confocal. Vire a lamínula para baixo e coloque-a no palco.
- Digitalize as imagens TC adquiridas nos comprimentos de onda do laser 405, 488 e 555 nm e salve as imagens no formato tiff (.tiff).
nota: Escolha um conjunto de filtros de detecção apropriado para os corantes de fluorescência (ou seja, máximos de excitação/emissão: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).
