Um método baseado em imunofluorescência para visualização de células de tufo em criosseções de jejuno

Abstract

Fonte: Mizutani, Y. et al., Uso de anticorpos antifosfo-girdina para visualizar células de tufo intestinal em criosseções de jejuno de camundongo flutuantes.J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo ilustra um método baseado em imunofluorescência para visualizar células de tufo intestinal em criossecções de jejuno de camundongo flutuantes. Dentro das vilosidades intestinais, a co-localização da fluorescência verde na ponta luminal com uma massa radicular vermelha estendida indica a presença de células de tufo.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparativos

1. Prepare 10 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS): 32,27 g de hidrogenofosfato de sódio (Na₂HPO₄·12H₂O), 4,5 g de di-hidrogenofosfato de sódio (NaH₂PO₄·2H₂O), 80,0 g de cloreto de sódio (NaCl) adicionado à água ultrapura até um volume final de 10 L. Armazene a solução em temperatura ambiente (RT).
2. Preparar 200 ml de PBS-T: 200 ml de PBS desde o passo 1.1 com 100 μL de éter octilfenílico de polioxietileno (10) até uma concentração final de 0,05% (vol: vol). Armazene na RT.
3. Enquanto estiver usando luvas e proteção para os olhos, prepare 50 mL de sacarose a 15% em solução de formalina neutra tamponada a 10%: 7,5 g de sacarose adicionada à solução de formalina neutra tamponada a 10% (Tabela de Materiais) até um volume final de 50 mL. Loja em RT.
   cuidado: A inalação e/ou o contato da pele/olhos com formaldeído em solução de formalina neutra tamponada a 10% podem ser perigosos. Manuseie com cuidado.
4. Prepare 1,5 mL de 200 unidades / mL de solução estoque de conjugado de corante faloidina-fluorescente: conjugado de corante faloidina-fluorescente (300 unidades em 1 frasco, sólidos liofilizados, excitação e comprimentos de onda de emissão: 581 nm e 609 nm, respectivamente) suspenso em 1,5 mL de metanol. Conservar a solução à escura a -20 °C.
5. Preparar 5 mg/ml de solução-mãe de dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI): 10 mg de DAPI em 2 ml de N-dimetilformamida (DMF). Conservar a solução à escura a -20 °C.
6. Prepare albumina de soro bovino (BSA) a 5% em PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Conservar a 4 °C.
7. Remova a ponta chanfrada de uma agulha reta de calibre 18 usando uma pinça e aperte a extremidade cortada com uma pinça no sentido longitudinal para permitir que o líquido flua através do lúmen da agulha (Figura 1A1).
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Dissecção de animais e isolamento do jejuno

1. Fixação de perfusão de um camundongo
   1. Use luvas e trabalhe em uma área bem ventilada.
   2. Prepare um copo de vidro de 100 mL, solução de formalina neutra tamponada a 10%, ferramentas cirúrgicas (tesoura, fórceps), uma bandeja metálica, suturas cortadas de náilon 6-0, uma agulha reta de calibre 18 preparada como em 1.7, uma agulha alada de calibre 22, uma seringa de 20 mL.
   3. Carregue 20 mL de solução de formalina neutra tamponada a 10% do copo de vidro para a seringa de 20 mL e conecte a agulha alada de calibre 22 à saída.
   4. Prepare a gelatina líquida adicionando 1 g de gelatina em pó a 20 mL de PBS (gelatina final de 5%) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Após imersão em RT por 15 min, incubar a 50 °C em banho-maria por 15 min sem agitar.
   5. Um breve vórtice e incube a 50 °C por mais 15 minutos para dissolver completamente a gelatina. Deixe o tubo em RT até o uso.
   6. Eutanásia de um camundongo adulto por luxação cervical.
   7. Coloque o mouse da etapa 2.1.6 em uma bandeja metálica e faça uma pequena incisão na pele através da cartilagem ensiforme usando ferramentas cirúrgicas.
   8. Expanda a incisão com as duas mãos para expor as regiões torácica e abdominal.
   9. Abra o peritônio para expor o diafragma e, em seguida, abra o diafragma em ambos os lados.
   10. Corte a caixa torácica ao longo das linhas axilares anteriores em ambos os lados e, em seguida, remova a parede torácica cortando na direção transversal na posição do timo para expor o coração.
   11. Faça uma pequena incisão na aurícula do átrio direito para drenar o sangue e insira uma agulha alada de calibre 22 no ápice do ventrículo esquerdo. Empurre o êmbolo para perfundir os tecidos com uma solução de formalina neutra tamponada a 10%.
   12. Depois de expor os órgãos da pelve, corte a extremidade do reto do ânus e separe os intestinos do corpo cortando o mesentério.
   13. Para isolar o jejuno, corte os intestinos a 4 cm do lado anal do antro gástrico. Descarte a metade anal do intestino delgado restante.
   14. Corte o jejuno ao meio para facilitar o procedimento de lavagem. Carregue 20 mL de solução de formalina neutra tamponada a 10% na seringa de 20 mL e conecte a agulha reta de calibre 18 preparada na etapa 1.7 na saída.
   15. Injete solução de formalina neutra tamponada a 10% de uma extremidade do jejuno cortado para limpar o conteúdo intestinal e fixar a superfície do lúmen intestinal ( Figura 1A2 ).
   16. Lave o lúmen intestinal injetando PBS conforme descrito na etapa 2.1.15.
   17. Lave a gelatina líquida no lúmen intestinal conforme descrito na etapa 2.1.15 para substituir o PBS por gelatina líquida.
   18. Feche uma extremidade do jejuno cortado por ligadura de sutura usando uma sutura de corte de náilon 6-0, encha o jejuno com gelatina líquida e feche a extremidade oposta por ligadura de sutura (Figura 1A3).
   19. Adicione quatro nós de sutura para encaixar uma seção de jejuno em forma de salsicha na porção deprimida de um criomold (Figura 1A4).
       nota: Para criomoldes com uma seção deprimida de 20 mm x 25 mm x 5 mm, uma seção de jejuno semelhante a uma salsicha de ~ 20 mm é preferível.
   20. Mergulhe os tecidos em 50 mL de sacarose a 15% em solução de formalina neutra tamponada a 10% durante a noite a 4 ° C.
       nota: Essas etapas garantem a crioproteção por sacarose e a fixação de proteínas por formalina da gelatina e do tecido. A gelatina gelatinizada com formalina não derrete em RT, enquanto a gelatina gelatinizada não fixa a 4 °C derrete em RT.

3. Congelamento instantâneo de tecidos de jejuno preenchidos com gelatina

1. Cortando-se o jejuno nos nós de sutura, obtêm-se três pedaços de jejuno em forma de salsicha com ambas as extremidades ligadas (Figura 1A4). Alinhe os pedaços semelhantes a salsichas em um criomoldor para a adição de composto de incorporação para a preparação de amostras de tecido congelado.
2. Congele o criomoldor em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Armazene os criomoldes a -80 °C
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Imunofluorescência de células de tufo usando criosseções flutuantes

1. Crioseccionamento
   1. Defina a temperatura da câmara do criostato (CT) e a temperatura do objeto (OT) para -22 °C. Coloque o bloco de tecido congelado em um criomold na câmara do criostato por pelo menos 15 min.
   2. Adicione 3 mL de PBS a uma placa de cultura de 35 mm.
   3. Remova o bloco de tecido congelado do criomold e corte o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno. Monte metade do bloco em um mandril (um adaptador de criostato) para seccionar o plano de corte com a lâmina de barbear.
   4. Corte o jejuno cheio de gelatina em seções de 30 μm de espessura. Use uma pinça congelada para transferir suavemente as seções para a placa de cultura de 35 mm preparada na etapa 4.1.2 (Figura 2B, à direita).
2. Aplicação de anticorpos primários
   1. Lave as seções flutuantes na placa de cultura de 35 mm 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T com agitação leve em um agitador recíproco (aproximadamente 36 vezes / min).
   2. Prepare a solução de recuperação de antígeno: 0,3 mL de concentrado de solução de recuperação de antígeno (Tabela de Materiais) em 2,7 mL de água ultrapura. Adicionar 3 ml de solução de recuperação de antigénios à placa de cultura de 35 mm que contém as secções flutuantes.
   3. Feche a tampa, feche o espaço entre o prato e a tampa com uma tira de fita adesiva e incube a 50 °C em uma incubadora de hibridização por 3 h sem agitar.
   4. Retire o prato da incubadora e deixe esfriar em RT por 20 min. Após remover a fita de vinil, lave as seções 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação leve.
   5. Aspire o PBS-T e adicione 5 gotas de solução de bloqueio (Tabela de Materiais) nas seções. Incubar em RT por 5 min com agitação leve.
   6. Prepare a solução de anticorpo primário: 495 μL de BSA a 5% em PBS com 5 μL de anticorpos fosfo-Y1798 girdina (pY1798) (Tabela de Materiais). Adicione 500 μL de solução primária de anticorpos nas seções (a solução de bloqueio não precisa ser removida).
   7. Colocar a cápsula numa câmara de incubação humidificada e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave.
      nota: A incubação noturna pode ser estendida para até três noites.
3. Aplicação de anticorpos secundários
   1. Lave as seções 3 vezes por 5 min cada em 3 mL de PBS-T com agitação suave.
   2. Preparar a solução-mãe DAPI diluída: 2 μL de solução-mãe DAPI (Etapa 1.5), 998 μL de PBS.
   3. Faça a solução de anticorpo secundário: 476 μL de BSA a 5% em PBS, 10,5 μL de solução DAPI diluída, 12,5 μL de solução estoque de conjugado de corante fluorescente de faloidina, 1 μL de conjugado de corante fluorescente IgG anti-coelho de cabra (comprimento de onda: excitação 496 nm, emissão 520 nm).
   4. Após aspirar o PBS-T, aplique a solução de anticorpos secundários e incube em uma câmara de incubação blindada contra luz em RT por 30 min com agitação leve.
   5. Lave as seções 3 vezes por 5 min cada com 3 mL de PBS-T e agitação leve.
   6. Após a lavagem final, remova o PBS-T e substitua-o por 3 mL de PBS sem éter polioxietileno (10) octilfenílico. Transfira a placa para um microscópio estereoscópico.
   7. Coloque 200 μL de PBS em uma gota no centro de uma lâmina de vidro branco revestida com MAS e transfira uma seção do jejuno do prato para a gota usando uma ponta de pipeta P200.
   8. Depois de ajustar o alinhamento da seção sob o microscópio estereoscópico, aspire todo o PBS restante ao redor da seção.
   9. Adicione 20 μL de meio de montagem aquoso e coloque uma lamínula de 20 x 20 mm sobre o meio.
   10. Vede imediatamente as bordas da lamínula com mídia de montagem à base de xileno. Coloque a lâmina em um mappe de madeira e deixe a mídia de montagem à base de xileno solidificar em RT por 2 a 3 h.
       nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Depois que a mídia de montagem à base de xileno se solidifica, as lâminas podem ser armazenadas por 2 a 3 semanas em uma caixa de lâminas blindada contra luz em RT.

5. Microscopia Confocal

1. Coloque óleo de imersão na objetiva 63X de um microscópio confocal. Vire a lamínula para baixo e coloque-a no palco.
2. Digitalize as imagens TC adquiridas nos comprimentos de onda do laser 405, 488 e 555 nm e salve as imagens no formato tiff (.tiff).
   nota: Escolha um conjunto de filtros de detecção apropriado para os corantes de fluorescência (ou seja, máximos de excitação/emissão: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).

Results

Figura 1: Preenchimento de gelatina de cortes de jejuno para preservação morfológica de criossecções
(A) Fotografias de procedimentos para preenchimento intraluminal de jejuno de camundongo com gelatina. (A1) A ponta chanfrada de uma agulha reta de calibre 18 foi removida para evitar perfurar a parede intestinal. (A2) Solução de formalina neutra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc: camundongos fêmeas DDY de 6 semanas	Chubu Kagaku Shizai	Não aplicável
Hidrogenofosfato dissódico 12-água (Na2HPO412H2O)	Wako	196-02835
Di-hidroenfosfato de sódio di-hidratado (NaH2PO42H2O	Wako	199-02825
Cloreto de sódio (NaCl)	Wako	199-10665
Triton X-100, éter polioxietileno(10) octilfenílico	Katayama Química	Não aplicável
sacarose	Wako	190-00013
Solução de formalina neutra tamponada a 10%	Muto Químico	20215	Etapa 1.3.
Conjugado de corante faloidina-fluorescente, Alexa Fluor 594 faloidina	ThermoFisher Scientific	A12381
metanol	Tesque Nacalai	Rolamento 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)	ThermoFisher Scientific	D1306
N.N-dimetilformamida (DMF)	Tesque Nacalai	13015-75
Albumina de soro bovino	sigma	A9647-10G
Agulha reta de aço inoxidável de calibre 18	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, sutura de corte de nylon de 60 cm, Crownjun	Kono Seisakusho	Não aplicável
Agulha alada de calibre 22	Terumo	SV-22DLK
Seringa TERUMO de 20 ml	Terumo	SS-20ES
Tubo de centrífuga de 50 mL	TPP	Rolamento 91050
Tubos de centrífuga Iwaki de 15 mL	Iwaki	Rolamento 2325-015
Microtubo de ensaio de 1,5 mL	estrela	RSV-MTT1.5
Gelatina em pó, Gelare-blanc	Nitta Biolab	Nº 2809
Composto de incorporação para amostra de tecido congelado, O.C.T. Composto 118 mL 12 peças	Sakura FineTech	Nº 4583
Criomolde, CRYO DISH No. 3, 125 peças, tamanho do poço 20 x 25 x 5 (mm)	Shoei Trabalho	1101-3
Isopentano	Tesque Nacalai	Rolamento 26404-75
Placa de cultura de células Falcon 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Concentrado de solução de recuperação de antígeno, solução de recuperação de alvo pH 9 10x	Dako	S2367	Concentrado da solução de recuperação de antigénios na etapa 4.2.2.
Bloco de proteína	Dako	X0909	Solução de bloqueio em 4.2.5.
Fosfo-Y1798 girdina (pY1798) anticorpos e produtos relacionados	Laboratórios de Imunobiológicos (IBL) = Empresa X	Rolamento 28143	Anticorpos fosfo-Y1798 girdina na etapa 4.2.6.
Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra anti-coelho IgG (H+L), Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11034
Meios de montagem aquosos, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	Pág. 36930
Lamínulas, Matsunami Micro Vidro de Cobertura 22 x 22 mm 100 pcs Espessura No.1	Vidro Matsunami	C022221
Entellan Novo meio de montagem à base de xileno para microscopia	Merck Millipore	107961
Vidro deslizante revestido com MAS branco	Vidro Matsunami	MI-MAS-01
Tapete de madeira tipo KO	Shoei Trabalho	Rolamento 99-40007
Óleo de Imersão 518 F Sem Fluorescência 20 ml	Zeiss	Nº 444960
Pipetas Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
Sistema de produção de água ultrapura	Advantec	GS-590
Luva de plástico, luva de nitrilo estrela	estrela	RSU-NGVM
Criostato	Leica Microsystems	CM1950
Congelador, SANYO Ultra Low	Sanyo	MDF-382
Geladeira vitrine	Freezer Nihon	NC-ME50EC
Banho-maria, Thermominder SDminiN (para dissolver a gelatina a 50 C)	Taitec	Nº 0068750-000
Incubadora de hibridização (para recuperação de antígenos a 50 C)	Taitec	HB-100
Câmara de incubação para imunocoloração	Cosmo Bio	10FAZER
Agitador recíproco para imuno-histoquímica (para temperatura ambiente)	Taitec	NR-1
Agitador recíproco para imuno-histoquímica (para 4 C)	Tóquio Rika Kikai	MMS-3010
Microscópio estereoscópico (para manuseio de tecidos)	Olimpo	SZ61
Microscópio estereoscópico (figura 1B)	Leica Microsystems	M165FC
Microscópio de fluorescência (figura 3)	Nikon	E800
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	LSM700