Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Transfecção de células 293T com luciferase e colheita de sobrenadante viral
- Cultura de células 293T
- Prepare o meio adicionando o seguinte a um litro de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) cada: 110 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina.
- Descongelar 5 x 106 células 293T e transferi-las para um balão T175 com o meio preparado conforme descrito acima.
- Divida as células 293T 1:10 a cada 3 dias por 6 dias. Não permita que as células se tornem mais de 90% confluentes.
- Transfecção de células 293T
nota: Calculam-se as seguintes quantidades de reagentes para a transfecção de um balão T175 de células 293T. Ajustar em conformidade se for necessário transduzir mais frascos.
- Transfira 1,5 mL de meio para cada um dos dois tubos de 50 mL usando uma pipeta. A um tubo, adicione 10 μg de plasmídeo VSV-G, 20 μg de Gag / pol e 20 μg de plasmídeo de luciferase de tomate TD vermelho de besouro click (CBR-TDR) e misture. Ao outro tubo, adicione 100 μL de reagente de transfecção in vitro de DNA e misture. Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
nota: Todos os plasmídeos descritos neste manuscrito foram fornecidos pelo Dr. Vladimir Ponomarev.
- Transferir o meio que contém o reagente de transfecção de ADN in vitro gota a gota para o tubo que contém os plasmídeos de ADN (durante cerca de 30 s) e misturar suavemente com uma pipeta. Incubar em RT por 20 min.
- Durante esta incubação de 20 minutos, retire as células 293T adicionando 5-10 mL de tripsina a 0,05%. Uma vez que as células tenham se desprendido, adicione 10 mL de meio e centrifugue a 800 x g por 5 min. Ressuspenda as células em 1,5 mL de meio.
- Adicionar os meios que contêm o reagente de transfecção de ADN in vitro e os plasmídeos de ADN às células 293T e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Transferir para um balão T175 e adicionar 18 ml de meio. Incubar a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem separar as células. Substitua por 18 mL de mídia fresca. Incubar a 37 °C durante a noite em uma incubadora.
- Colheita de sobrenadante viral
- Remova o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo. Centrifugue a 800 x g por 5 min para peletar as células e detritos.
nota: Se o pellet celular for grande, as células provavelmente foram removidas do frasco quando o sobrenadante foi removido. Essas células podem ser semeadas novamente em um novo frasco com meio fresco.
- Filtrar o sobrenadante viral utilizando um filtro de 0,22 μm.
- Use o sobrenadante viral imediatamente. Mantenha-o no gelo ou a 4 °C por até 24 h, ou congele-o a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
2. Expansão e transdução de células T humanas ativadas com luciferase
- Ativação de células T humanas in vitro
- Lave as esferas adicionando 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a um tubo estéril de 15 mL, adicionando esferas (uma conta para duas células T), colocando em um suporte magnético por 2 min e aspirando o PBS.
- Prepare o meio conforme descrito na etapa 1.1.1, adicione IL-2 a uma concentração final de 30 UI / mL e adicione os grânulos lavados. Faça 2,5 mL de meio para cada dois milhões de células T a serem ativadas.
- Conte as células T (recém-purificadas ou previamente purificadas, congeladas, descongeladas e lavadas) usando um hemocitômetro e coloração azul de tripano. Adicione células T ao meio preparado na etapa 2.1.2 e inverta suavemente o tubo para misturar. As células T se expandirão pelo menos 20x, dependendo da fonte e da saúde geral das células. Determine o número de células T a serem ativadas calculando o número necessário para tratar os camundongos e dividindo por 20. Aqui, 20 x 106 células T por camundongo foram usadas com base em experimentos preliminares.
- Placa 2,5 mL de meio contendo dois milhões de células T, grânulos e (interleucina 2) IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultivar a 37 °C em incubadora umidificada de CO2 a 5%.
- Examine as células T sob um microscópio de 20x todos os dias pelos próximos 3 dias para determinar quando transduzir com luciferase. As células estão prontas quando se aglomeram e esgotam a mídia, transformando-a de vermelho/rosa em laranja claro.
- Preparação de placas de retronectina
nota: A retronectina é usada para revestir as placas usadas na transdução, pois aumenta a transdução gênica.
- Adicione 2 mL de 20 μg / mL de retronectina em PBS a um poço de uma placa de 6 poços não tratada. Incubar durante 2 h à temperatura de recarga ou 1 h a 37 °C. Um poço revestido com retronectina é necessário para cada dois milhões de células T a serem transduzidas.
- Aspire a retronectina sem arranhar o fundo da placa.
- Adicione 3 mL de BSA a 2% em PBS (filtrado estéril) por poço na placa de 6 poços. Incubar por 30 min em RT.
- Espinação
- Aspire o BSA sem arranhar o fundo da placa.
- Lave os poços uma vez com 3 mL de PBS por poço. Continuar ou substituir por PBS novo e deixar a placa coberta a 4 °C durante a noite.
- Adicione 2 mL de sobrenadante viral de luciferase CBR-TDR (coletado na etapa 1.3) por poço.
- Centrifugue a 1.240 x g por 90 min a 32 °C.
- Transdução
- Conte as células T.
- Aspire o sobrenadante viral sem arranhar o fundo da placa.
- Plaquear dois milhões de células T por alvéolo em 6 mL de DMEM contendo 30 UI/mL de IL-2 humana.
- Examine as células T diariamente. As células T estão prontas para serem expandidas quando estão quase confluentes, geralmente após 2 dias.
- Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um frasco T75 separado. Adicione 9 mL de mídia para um total de 15 mL de mídia por frasco.
- No dia seguinte, adicione mais 15 mL de mídia. As células devem estar prontas para serem injetadas em camundongos no dia seguinte a essa adição de meio. Confirme a transdução bem-sucedida realizando citometria de fluxo (a construção da luciferase contém um fluoróforo de tomate TD que é visível no canal PE).
3. Enxerto de células T transduzidas por luciferase em camundongos imunocomprometidos
- Prepare e conte as células T para injeção.
- Remova as células T dos frascos e conte. As células estão prontas para injetar quando se expandem 20x-30x, geralmente no dia 7 após a ativação.
- Centrifugue as células T a 800 x g por 5 min. Ressuspenda em 2 mL de meio e remova as esferas usando um rack magnético.
- Para experimentos em que as células T serão injetadas separadamente dos anticorpos biespecíficos, conte as células T e ressuspenda de modo que a concentração final seja de 20 milhões de células T por 100 μL de meio. Pule para a etapa 3.2. Para experimentos usando células T armadas ex vivo (EATs), pule para a etapa 3.1.4.
- Para experimentos usando células T armadas ex vivo, conte as células T e separe-as em tubos individuais de 1,5 mL para cada grupo, com 20 milhões de células por camundongo. Por exemplo, se houver três grupos de cinco camundongos cada, prepare três tubos de 1,5 mL com 100 milhões de células T cada.
- Centrifugue os tubos de 1,5 ml a 800 x g durante 5 min. Retire o meio cuidadosamente sem perturbar o grânulo de células T. Ressuspenda em não mais de 50 μL de meio contendo os anticorpos biespecíficos. Incubar em RT por 30 min.
nota: Para os propósitos dos experimentos conduzidos neste estudo, foram usados anticorpos biespecíficos proprietários de engajamento de células T IgG-[L]-scFv gerados em laboratório. Para armar células T, use 5 μg de anticorpo por 20 x 106 células T. Anticorpos biespecíficos disponíveis comercialmente também podem ser usados.
- Lave o excesso de anticorpos adicionando 1.450 μL de meio a cada tubo. Centrifugue a 800 x g por 5 min, aspire cuidadosamente o meio e ressuspenda a uma concentração de 20 milhões de células T armadas por meio de 100 μL.
- Injeção e enxerto em camundongos
- Anestesiar os camundongos em uma câmara que forneça isoflurano inalado a 3,5% (v/v) em oxigênio a 1 L/min. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
NOTA: Forneça suporte térmico durante todo o procedimento.
- Usando uma agulha de 26 G, injete 20 milhões de células T em 100 μL de meio retroorbitalmente por camundongo.
- Administre 1.000 U de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência das células T in vivo.
- Administre os anticorpos biespecíficos retroorbitalmente (no olho não usado para injeção de células T) ou intraperitonealmente. Permita que os camundongos se recuperem da anestesia e retornem às suas gaiolas.
NOTA: Novamente, aqui, anticorpos proprietários que foram gerados no laboratório foram usados, mas anticorpos disponíveis comercialmente podem ser usados. Nos experimentos aqui, 0,3-10 μg de anticorpo por camundongo por dose foi administrado. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 3-4 semanas.
4. Imagem in vivo de camundongos enxertados com células T transduzidas por luciferase
NOTA: Esta etapa deve ser realizada no dia da imagem, que não é necessariamente o mesmo dia em que as células T e/ou anticorpos são administrados aos camundongos. Normalmente, realizamos exames de imagem 24 horas após a administração das células T transduzidas por luciferase.
- Preparação de D-luciferina
- Dissolva 1 g de D-luciferina em 33,3 mL de PBS estéril (concentração final: 30 mg / mL).
- Alicotar a D-luciferina dissolvida em tubos de microcentrífuga de 33 x 1,5 mL e manter os tubos a -20 °C.
- No dia da imagem, descongele alíquotas suficientes de 30 mg / mL de D-luciferina para o número de animais a serem fotografados. Uma bisnaga é suficiente para 10 animais.
NOTA: Congele novamente a D-luciferina restante após o uso. A D-luciferina é estável por pelo menos cinco ciclos de congelamento / descongelamento.
- Administração de D-luciferina a camundongos
nota: Antes de administrar D-luciferina aos ratos, abra o software de imagem e inicialize o sistema. A câmera pode levar vários minutos para esfriar, e isso deve ser feito antes que os camundongos sejam injetados com D-luciferina para garantir que a imagem possa ocorrer 5 minutos após a administração do substrato.
- Anestesiar até cinco camundongos em uma câmara que fornece isoflurano inalado a 3,5% (v/v) em oxigênio a 1 L/min. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
- Uma vez que os camundongos estejam totalmente anestesiados, administre 100 μL de 30 mg / mL de D-luciferina por camundongo (3 mg por camundongo) por injeção retroorbital com uma agulha de 26 G. Imagine este grupo de camundongos antes de administrar D-luciferina ao próximo grupo. Coloque o próximo grupo de camundongos na câmara de isoflurano para ser anestesiado enquanto o grupo anterior está sendo fotografado.
- Imagem de células T transduzidas por luciferase
- Mova os camundongos anestesiados para a câmara à prova de luz do gerador de imagens e continue administrando isoflurano a 3% a 0,5 L / min. Coloque os camundongos de lado de forma que o flanco que carrega o xenoenxerto fique voltado para a câmera. Faça outro conjunto de imagens com os camundongos em decúbito dorsal para avaliar a presença de células T nos pulmões.
- Usando o Painel de controle de aquisição, selecione Luminescente, Fotografia e Sobreposição. Defina o tempo de exposição para automático, o binning para médio e F/Stop para 1. Adquira imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao que foi calculado automaticamente para a primeira imagem, para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Pode ser útil capturar imagens com vários tempos de exposição para determinar o tempo de exposição ideal para obter o sinal mais brilhante sem saturação de pixels.
- Remova os camundongos do isoflurano, retorne às gaiolas e observe até que estejam acordados e deambulando.
- Repita as etapas da etapa 4.2.1 até que todos os grupos tenham sido criados.
