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1. Culturas de células e parasitas
- Cultive células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) da American Type Culture Collection (CCL-7) em um frasco de cultura decélulas 2 de 25 cm contendo em meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino) inativado por calor e antibióticos (100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) a 37 ° C em 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Infectar células LLC-MK2 com Trypanosoma cruzi (cepa Y) de acordo com um protocolo anterior.
- Colete o sobrenadante das células infectadas com LLC-MK2 (5 mL) em um tubo de centrífuga cônico de cultura de células de 15 mL e centrifugue a 500 x g por 10 minutos e 22 ° C para diminuir os detritos celulares. Manter o tubo durante 10 minutos a 37 °C para permitir que os tripomastigotas nadem até ao sobrenadante.
- Recolher o sobrenadante num novo tubo cónico e centrifugar a 2500 x g durante 15 minutos a 22 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento contendo os parasitas num meio RPMI completo para determinar a densidade celular por contagem das células numa câmara de Neubauer.
2. Protocolo de imunofluorescência de controle
NOTA: Uma vez fixadas, é possível armazenar placas contendo lamínulas a 4 °C em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) (pH 7,2) por uma semana. Para serem armazenadas, é importante que as células não tenham passado pela etapa de permeabilização.
- Deposite as células LLC-MK2 (2 x 104) em placas de 24 poços contendo lamínulas arredondadas esterilizadas ultravioleta (UV) em meio RPMI por 16 horas.
- Para células infectadas, adicionar um sobrenadante contendo T. cruzi (item 1.4) a cada poço em proporção (multiplicidade de infecção, MOI 10:1) e deixar por 6 h de infecção. Lave lamínulas contendo células infectadas e não infectadas cinco vezes com solução de PBS e fixadas com paraformaldeído a 2% em 1x PBS (pH 7,2) por 10 min em temperatura ambiente (RT).
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS (pH 7,2).
- Permeabilizar as lamínulas com 0,2% de IGEPAL CA-630 (octilfenoxipolietoxietanol) em 1x PBS (PH 7,2) por 10 min em RT.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Incubar lamínulas por 30 min em RT com a solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 2%, BSA em 1x PBS, pH 7,2).
- Incubar lamínulas por 30 min em RT com anticorpos monoclonais anti-hnRNPA1 de camundongo (anti-heterogenea ribonucleoproteína-A1) (diluição 1:200) ou com anticorpos policlonais de camundongo anti-TcFAZ (proteína da zona de ligação do flagelo anti-Trypanosoma cruzi) (diluição 1:100) diluídos em solução de bloqueio.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Incubar as lamínulas por 30 min em RT com IgG F (ab')2 (H+L) anti-camundongo de cabra conjugada a Alexa Fluor 488 (1:600) juntamente com faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) para corar filamentos de actina (F-actina) na célula hospedeira diluída na solução de bloqueio.
- Lave três vezes com 1x PBS (pH 7,2) por 5 min cada.
- Aplique uma pequena quantidade de reagente de montagem antidesbotamento ProLong Gold com meio 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) na superfície da lâmina.
- Usando uma pinça, incline suavemente a lamínula no meio de montagem para evitar a formação de bolhas. Depois de seco, sele a lamínula, se desejar.
3. Protocolo de imunofluorescência de dupla marcação usando anticorpos monoclonais e policlonais criados no mesmo hospedeiro
- Repita as etapas 2.1 a 2.6 descritas acima.
- Incubar lamínulas contendo células infectadas e não infectadas com anticorpo anti-TcFAZ policlonal de camundongo (1:100) diluído em solução de bloqueio por 30 min em RT.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Incubar lamínulas por 30 min em RT com IgG F (ab')2 (H+L) anti-camundongo caprino conjugado a Alexa Fluor 647 (1:600) diluído na solução de bloqueio.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Execute a segunda etapa de bloqueio com AffiniPure rabbit anti-mouse IgG (H+L) diluído (0,12 mg/mL) em solução de bloqueio por 30 min em RT.
- Lave as lamínulas três vezes com 1x PBS (pH 7,2) por 5 min cada. Em seguida, incubar com anticorpo monoclonal de camundongo anti-hnRNP A1 IgG2b (1:200) por 30 min em RT.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Incubar as lamínulas por 30 min com anticorpo IgG2b anti-camundongo de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (1:600) e com faloidina conjugada a Alexa 594 (1:300) diluída na solução de bloqueio.
- Lave as lamínulas três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
- Repita as etapas 2.8 a 2.10 descritas acima.