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1. Purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade usando um sistema automatizado de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC)
NOTA: O procedimento a seguir geralmente pode ser aplicado à maioria dos sistemas automatizados. A purificação pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 °C (se o sistema FPLC for mantido em uma sala fria). Uma série de testes de reconhecimento pode ser realizada para identificar as condições ideais de purificação, incluindo matriz de coluna apropriada, tampão de ligação, tampão de eluição e pH para garantir a recuperação máxima do anticorpo purificado do meio condicionado (consulte a seção Resultados). As condições ideais dependem do anticorpo ou proteína que está sendo purificado. As purificações foram realizadas em um sistema FPLC automatizado. As purificações foram realizadas à temperatura ambiente usando uma coluna de proteína A de 5 ml.
- Prepare os seguintes tampões usando água ultrapura e ajuste ao pH recomendado e filtre com um filtro de 0,22 μm.
- Prepare 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (tampão de ligação) misturando o seguinte: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 e 0,001 M KH2PO4. Ajuste o pH, se necessário, antes de filtrar o tampão.
- Preparar 500 ml de glicina-HCl 0,1 M pH 2,7 (tampão de eluição). Ajuste o pH antes de filtrar o tampão.
- Prepare 50 ml de Tris 1 M pH 9,0 (tampão de neutralização).
- Certifique-se de que todas as conexões de alimentação e comunicação do sistema com o computador sejam feitas. Os dispositivos devem estar visíveis no módulo 'System Control' do software. Certifique-se de que a célula UV esteja ajustada no comprimento de onda de 280 nm. Opcional: Calibre o medidor de pH se conectado e a ser usado.
- Mergulhe os tubos de entrada de A, B e sample bomba em água ultrapura para lavar o sistema. Purgue as bombas com uma seringa se houver ar na tubulação ou suspeita de ar no sistema. Lave o sistema com água por operação manual através do controlador do sistema ou através de um método automatizado. Observe que a pressão, a condutividade, o traçado UV280 e o pH permanecem consistentes e que o limite de pressão para a coluna não é excedido de acordo com a especificação do fabricante.
nota: Anormalidades podem indicar ar ou bloqueio no sistema que deve ser tratado antes de prosseguir.
- No módulo do controlador do sistema, inicie a vazão a 1 ml/min manualmente através da bomba A na posição de carga (ignorando o loop de amostra) ou injete (através do loop de amostra) para começar a conectar a coluna. Desconecte a tubulação do sistema na entrada de posição da coluna e remova o batente conectado à entrada da coluna.
- Deixe a água fluir da tubulação do sistema gota a gota no topo da coluna e, em seguida, conecte a tubulação do sistema à coluna. Ter a entrada da coluna e o encaixe de entrada transbordando com gotas de água garante uma conexão livre de bolhas de ar.
- Conecte a saída da coluna na saída a jusante e verifique se todos os acessórios estão bem presos. Com a coluna agora conectada ao sistema, não exceda os limites de limite máximo de pressão e vazão conforme descrito nas especificações da coluna.
- Coluna de lavagem com 5 volumes de coluna (CV) de água. Se necessário, continue a lavagem da coluna até que o traçado UV280 se estabilize.
- Mergulhe os tubos de entrada de A no tampão de ligação, B no tampão de eluição e sample bomba no tampão de ligação para equilibrar o sistema nos tampões corretos. Encha os tubos de entrada com tampão usando PumpWash por operação manual.
- No módulo 'Editor de Métodos' do software, use o assistente de método para configurar um método de cromatografia de afinidade para a coluna que se pretende usar.
nota: Os sistemas FPLC automatizados vêm com métodos pré-preenchidos com as configurações recomendadas (ou seja, vazão e limite de pressão) e executam etapas com base na coluna (fabricante, matriz e tamanho) selecionada para purificação.
- Use as seguintes etapas de execução para cromatografia de afinidade da proteína A:
- Equilibre o sistema com 5 CV de buffer de ligação e colete o fluxo no recipiente de resíduos.
- Carregue a amostra na coluna (o volume a ser carregado é especificado manualmente no método) e colete o fluxo em um recipiente separado.
- Lave o sistema com 5 CV de buffer de ligação e colete o fluxo em um recipiente separado.
- Eluir a coluna com fracionamento isocrático de 5 CV usando tampão de eluição e coletar amostra de anticorpos purificados como frações por coletor de frações.
- Equilibre o sistema com 5 CV de buffer de ligação e colete o fluxo no recipiente de resíduos.
- Uma vez que o método tenha sido configurado, especifique o volume de mídia condicionada a ser aplicado à coluna e salve o método.
nota: O volume especificado no método deve ser 5-10 ml menor que o volume real para evitar a introdução de ar durante a execução da amostra. O volume especificado usado neste protocolo é de 90-120 ml.
- Mergulhe o sample tubulação da bomba no recipiente que contém o meio condicionado.
- Prepare um recipiente separado para coletar o fluxo de amostra através da tubulação de saída especificada.
nota: É importante coletar o fluxo caso ocorra um erro durante a execução ou a capacidade de ligação da coluna seja excedida, exigindo que o fluxo seja reaplicado à coluna ou a purificação repetida.
- Prepare os tubos de coleta no coletor de frações. Adicionar 100 μl de tampão de neutralização por cada volume de fracção de 1 ml. O sistema FPLC eluirá automaticamente as frações nos tubos de coleta.
- No módulo 'Controle do Sistema' do software, abra o método a ser executado.
nota: A execução do método é iniciada em uma série de páginas que incluem a verificação das variáveis do método, a configuração do coletor de frações e a definição do nome do arquivo de resultados e do local de armazenamento.
- Clique em INICIAR para iniciar a execução. A corrida pode ser monitorada no módulo 'Controle do sistema'.
- No final da depuração, verifique o cromatograma resultante no módulo 'Avaliação' no software do sistema.
- Combinar todas as fracções que contêm proteínas num tubo separado, trocar tampão e concentrar-se em PBS utilizando um dispositivo de filtro centrífugo com 30 kDa de peso molecular cortado. Executar as etapas de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante.
- Meça a concentração de anticorpos usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
- Se outra execução de purificação for realizada, prepare o sample tubulação da bomba em tampão de ligação e repita as etapas 1.9-1.14.
- Na conclusão das corridas de purificação, mergulhe os tubos de entrada de A, B e a bomba de amostra em água ultrapura e lave o sistema e a coluna conforme realizado na etapa 3.
- Mergulhe A, B e sample a tubulação da bomba em etanol a 20% e repita o procedimento de lavagem para armazenamento do sistema e da coluna.
- Desconecte a coluna da saída a jusante e substitua o batente da coluna, depois desconecte a coluna na entrada e recoloque o bujão, reconecte a tubulação ao sistema. Armazenar a coluna a 4 °C.