Uma técnica de coloração por imunofluorescência para detectar a neurogênese do hipocampo adulto

Resumo

Fonte: Ansorg, A., et al. Imuno-histoquímica e marcação múltipla com anticorpos da mesma espécie hospedeira para estudar a neurogênese do hipocampo adulto. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo ilustra um método de coloração por imunofluorescência usado para examinar a neurogênese no hipocampo adulto. Inicialmente, uma seção do cérebro de camundongo é submetida a tratamento com anticorpos primários direcionados a proteínas marcadoras associadas à neurogênese em células progenitoras neuronais. Em seguida, é marcado com anticorpos secundários marcados com fluoróforos. A seção cerebral é então observada sob um microscópio confocal para distinguir vários subtipos de células progenitoras, com base nos padrões de expressão de combinações distintas de proteínas marcadoras.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de tecidos

1. Prepare formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 no dia anterior à perfusão. Conservar a 4 °C.
2. Perfundir transcardialmente os camundongos profundamente anestesiados (isoflurano a 3,5%) através do ventrículo esquerdo com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada e, em seguida, com 40 ml de formaldeído gelado (vazão de 5 ml / min). Dissecar o cérebro e pós-fixar no mesmo fixador por 24 horas a 4°C.
3. Transfira os cérebros consecutivamente para 10% (24 horas a 4 ° C) e 30% de sacarose (até que o cérebro afunde, aprox. 48 horas). Para congelar, mergulhe lentamente os cérebros crioprotegidos em isopentano a -25 °C até que não surjam bolhas do tecido. Conservar a -80 °C.
4. Corte cortes coronais de 40 μm de espessura em um micrótomo de congelamento (temperatura do bloco de -25 a -16 °C). Transfira sequencialmente as seções para a solução anticongelante contendo poços de uma placa de cultura de células de 24 poços (ver Figura 1). Conservar a -20 °C.

2. Imunomarcação

NOTA: As seções são processadas flutuando livremente, geralmente em placas de 6 poços equipadas com uma placa de suporte e inserções de malha. Como exceção, o bloqueio, as incubações de anticorpos e as reações do complexo avidina-biotina (ABC) são feitos em placas de 12 ou 24 poços sem inserções de malha (0,5 a 1 ml por poço é suficiente, dependendo do número de fatias que precisam ser coradas). Durante essas etapas, transfira as seções com a ajuda de um pincel fino (enxágue a cada nova solução). Todas as incubações são feitas com agitação contínua (máx. 150 rpm).

1. Imuno-histoquímica (método ABC)
   1. Transfira seções do anticongelante para solução salina tamponada com tris (TBS) e enxágue abundantemente (uma vez O/N a 4 °C, 5 vezes em temperatura ambiente [RT] por 10 min cada) para remover completamente o anticongelante.
   2. Para extinguir a atividade da peroxidase endógena, incubar por 30 min em 1,5% H₂O₂ em TBS-Tween 20 (TBS-T). Preste atenção às seções borbulhantes e submersas, se necessário. Enxágue 3 vezes em TBS por 15 min cada.
   3. Opcional: Enquanto isso, pré-aqueça um gabinete de aquecimento e HCl 2 N a 37 °C. Para desnaturar o DNA, incube as seções por 30 min a 37 ° C em HCl 2 N. Separe suavemente as seções com a ajuda de um pincel.
   4. Opcional: Neutralize as seções por 10 min em tampão borato 0,1 M pH 8,5, RT. Durante a transferência, limpe brevemente as inserções de malha contendo as seções em uma toalha de papel para remover os restos de HCl. Enxágue 2 vezes em TBS por 15 min cada.
   5. Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear locais de ligação de anticorpos inespecíficos por 1 hora em RT.
   6. Incubar em anticorpo primário diluído em TBSplus, O/N a 4 °C. Enxaguar 3 vezes em TBS durante 15 min cada.
   7. Incubar em anticorpo secundário biotinilado diluído em TBSplus por 3 horas em RT. Enxaguar 3 vezes em TBS por 15 min cada. Entretanto...
   8. Prepare o complexo ABC de acordo com o protocolo do fabricante (1% A + 1% B em TBS-T). Deixe repousar por 30 min em RT antes de usar. Incube as seções em reagente AB por 1 hora em RT. Enxágue 3 vezes em TBS por 15 min cada.
   9. Preparar 50 ml de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) a 0,5 mg/ml em TBS-T por placa de 6 ou 12 poços, divididos em duas metades, e pipetar 4 ml ou 2 ml por alvéolo, respetivamente. Transfira as seções para a solução DAB (CUIDADO! DAB é tóxico. Siga as MSDS específicas fornecidas pelo fornecedor, ou seja, use jaleco e luvas e use um exaustor químico).
   10. Adicione 0,5 ml de H₂O₂ a 1% aos 25 ml restantes de solução de DAB, misture e pipete os volumes equivalentes acima em cada poço para iniciar a reação da peroxidase. Incubar por 12 min. Enxágue 3 vezes em TBS por 15 min cada.
   11. Monte as seções em lâminas em gelatina e seque ao ar O/N. Lamínula com meio de montagem permanente.
   12. Opcional: Contra-manchar antes de colocar a lamínula.
       nota: Se a relação sinal-ruído for baixa devido ao fundo elevado, repetir o tratamento com H₂O₂ após a incubação com reagente AB (passo 2.1.8).
2. Imunofluorescência múltipla
   1. Imunofluorescência múltipla única ou simultânea
      1. Transfira as secções do anticongelante para o TBS e enxágue abundantemente (uma vez O/N a 4 °C, 5 vezes em RT durante 10 min cada) para remover completamente o anticongelante.
      2. Opcional: conforme as etapas 2.1.3 a 2.1.4.
      3. Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear locais inespecíficos de ligação de anticorpos, 1 hora em RT.
      4. Incube em coquetel de anticorpos primários (por exemplo, α-BrdU de rato (bromodeoxiuridina), α-DCX de cobaia (doublecortin), α-GFP de cabra (proteína fluorescente verde)) diluído em TBSplus, O/N a 4°C. Enxágüe 3 vezes em TBS por 15 min cada.
      5. Incubar em um coquetel de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo (por exemplo,., Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cobaia, Alexa-488 α-cabra; todos derivados em burro) diluídos em TBSplus, 3 horas em RT ou O/N a 4 °C. A partir de agora, proteja as seções da luz. Enxágue 3 vezes em TBS por 15 min cada.
      6. Monte as seções em lâminas em gelatina e seque ao ar durante a noite (O/N). lamínula com suporte aquoso.
   2. Imunofluorescência múltipla sequencial com anticorpos primários da mesma espécie hospedeira
      1. Como as etapas 2.2.1.1 a 2.2.1.3.
      2. Incube no primeiro anticorpo primário (por exemplo, antígeno A α de coelho), O/N a 4 °C. Enxágue 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada.
      3. Incubar no primeiro anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (por exemplo, Rhodamine Red-conj. burro α-coelho), 3 horas RT. A partir de agora, proteja as seções da luz. Enxágue 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada.
      4. Incubar em soro normal a 10% do mesmo hospedeiro que os anticorpos primários (por exemplo, soro de coelho) por RT de 3 horas para saturar os paratopos abertos no primeiro anticorpo secundário. Enxágue 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada.
      5. Incubar em TBSplus com 50 μg/ml de fragmentos monovalentes não conjugados de Fab dirigidos contra o hospedeiro dos anticorpos primários (por exemplo, IgG de α coelho (H+L)) para cobrir epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário, O/N a 4 °C.
      6. Enxágue pelo menos 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada. Durante a transferência, limpe brevemente as inserções de malha contendo as seções em uma toalha de papel para remover quaisquer restos de Fab.
      7. Incube no segundo anticorpo primário (por exemplo, α-antígeno B de coelho), O/N a 4 °C. Enxágue 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada.
      8. Incube em segundo anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (por exemplo, Alexa-488-conj. burro α-coelho), 3 horas RT. Enxágue 3 vezes em TBS por 15 min cada, monte e aplique a lamínula como acima.
         nota: Para rotular os antigénios com anticorpos de diferentes espécies hospedeiras, adicione-os ao passo 2.2.2.2 e os respetivos anticorpos secundários ao passo 2.2.2.3.

Resultados

Figura 1. Ilustração esquemática da transferência de fatias de micrótomo para uma placa de 24 poços. Comece em A1 e coloque as fatias subsequentes na linha A; depois de A6, vá para a próxima linha B e assim por diante. Ao chegar a D6, volte para A1 e continue. Esse arranjo de fatias permite a quantificação de cada seção n de um cérebro inteiro. Para quantificação de células recém-nascida...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Preparação de tecidos
Isoflurano-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Paraformaldeído em pó (PFA)	Riedel-de häen	16005	tóxico, inflamável
Bomba de perfusão PD5206	Instrumentos Heidolph	523-52060-00
Tubo de laboratório Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Agulha de alimentação, reta, 21 G, ponta verde-oliva de 1,75 mm, 40 mm	Agnthos	1036
Micrótomo de congelamento Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Placas multipoços de cultura celular de 24 poços	Greiner Bio-One	662160
Imuno-histoquímica
Vaporizador Tefal vitacuisine	Tefal	VS 4001
Inserções de membrana de malha de poliéster Netwell de 24 mm	Corning	3479	pré-carregado em placas de cultura de 6 poços
Inserções de membrana de malha de poliéster Netwell de 15 mm	Corning	3477	pré-carregado em placas de cultura de 12 poços
Kit de suporte de plástico Netwell de 6 poços	Corning	3521	para inserções de membrana de malha de poliéster de 24 mm
Kit de suporte de plástico Netwell de 12 poços	Corning	3520	para inserções de membrana de malha de poliéster de 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Laboratórios de Vetores	PK-6100
DAB (hidrato de cloridrato de tetra-hidrogênio de 3,3′-diaminobenzidina)	Sigma-Aldrich	D-5637	Carcinogênico, sensível à luz
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Anticorpos primários
coelho IgG1 α-Ki67
coelho α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/SE 1:100; requer recuperação de epítopo
IgG de cabra (H+L) α-GFP	Sistemas Sinápticos	173 002	09:20
mouse IgG1 α-nestin	Acris Anticorpos e Produtos relacionados à China	R1091P	06:00
porquinho-da-índia IgG (H+L) α-Doublecortin	Abcam	ab6142	1:200; requer recuperação de epítopo
rato IgG2a α-BrdU (ascite)	Merck Millipore	AB2253	09:20
rato IgG2a α-BrdU (purificado)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	para detecção de BrdU; DAB 1:500/SE 1:400
mouse IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	para detecção de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
mouse IgG1 α-NeuN	BD Biosciences	347580	para detecção de IdU; DAB 1:500/SE 1:350
Anticorpos secundários	Merck Millipore	MAB377	09:20
burro α-cobaia IgG (H+L)-Biotina
burro α-rato IgG (H+L)-Biotina	Dianova	711-065-152	09:20
burro α-camundongo IgG (H+L)-Biotina	Dianova	712-065-150	09:20
cabra α-rato IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	715-065-151	09:20
burro α-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares	A11006	05:10
burro α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragmento	Sondas Moleculares	A11055	05:10
burro α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-097-003	02:40
burro α-cobaia IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	05:10
burro α-rato IgG (H+L)-Vermelho de Rolamina-X	Dianova	706-605-148	05:10
burro α-coelho IgG (H+L)-Vermelho de Rolamina-X	Dianova	712-295-150	05:10
burro α-cobaia IgG (H+L)-Vermelho de rodamina-X	Dianova	711-295-152	05:10
Estreptavidina-Vermelho de Rolamina-X	Dianova	706-296-148	05:10
IgG de α-coelho de cabra (H+L)-AMCA	Dianova	016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova	111-155-144	1:250, funciona apenas com coelho α-GFAP
DAPI	Sondas Moleculares	H3570	17:40
Bloqueio	Sondas Moleculares	D1306	17:40
IgG de burro de fragmento de fab α-mouse (H + L)
IgG de burro de fragmento de fabulosa α-coelho (H+L)	Dianova	715-007-003	01:20
Soro de burro normal	Dianova	711-007-003	01:20
Soro normal de coelho	Merck Millipore	S30
Soro de cabra normal	Dianova	011-000-010
Albumina de Soro Bovino	Dianova	005-000-001
Histologia	Sigma-Aldrich	A7906
Violeta cresila
Neo-Clear	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Montagem	Merck Millipore	109843	Substituto não tóxico do xileno
Microscopia	Merck Millipore	109016	Meio de montagem permanente
Axioskop 2
LSM 710	Microscopia Carl Zeiss
	Microscopia Carl Zeiss