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1. Preparação dos animais
- Anestesiar os camundongos com isoflurano a 3%. Abra o tórax fazendo uma incisão horizontal na região acima do abdômen médio e puxando a pele. Faça cuidadosamente outra incisão para abrir a cavidade torácica sem perfurar nenhum outro órgão.
- Perfunda o coração primeiro através do ápice e depois do ventrículo direito usando glutaraldeído frio a 3% em solução cardioplégica (50 mM KCl, 5% de dextrose em PBS, ver Tabela 1) por 2 min para garantir o relaxamento miocárdico completo.
- Perfunda o coração usando glutaraldeído a 3% gelado em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio (pH 7,4) por mais 2 min. Usando a pressão da gravidade, use uma agulha de 25 G 5/8" para introduzir os fixadores no coração. Imediatamente após o coração começar a se encher com o fixador, levante o ápice do coração e corte os vasos embaixo a 1-2 mm do coração para aliviar a pressão e permitir que os líquidos escorram.
- Disseque o coração, remova os átrios e coloque os ventrículos em um cacodilato de sódio gelado a 3% de glutaraldeído / 0,1 M em uma placa de Petri. Faça um corte borboleta após 30-60 min de fixação e coloque-o em uma placa de Petri contendo 3% de glutaraldeído/cacodilato (ver Tabela de Materiais). Pique o coração usando uma lâmina cirúrgica em cubos pequenos de 1 mm3 enquanto estiver em solução de glutaraldeído/cacodilato.
- Fixar/mergulhar o tecido cardíaco dissecado em solução de glutaraldeído/cacodilato durante 24 h a 4 °C.
2. Processamento do tecido cardíaco
- Após 24 h de fixação, lavar os tecidos em tampão cacodilato de sódio 0,1 M por 20 min.
- Prepare o tampão de cacodilato 0.1 M seguindo as etapas abaixo.
- Para preparar tampão cacodilato de sódio 0,1 M, prepare um estoque de tampão cacodilato de sódio 1 M dissolvendo o cacodilato de sódio (21,4 g) e a solução de cloreto de cálcio a 1% (3 mL) em 90 mL de água destilada. Aumente o volume da solução para 100 mL adicionando a água destilada. Agite bem a solução e deixe durante a noite para dissolver o soluto.
- Em seguida, pegue 10 mL de solução estoque de cacodilato de sódio 1 M e adicione-a a 80 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,4 usando HCl e aumente o volume para 100 mL adicionando água destilada.
- Repita a lavagem em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M por mais 20 min. Remova os tecidos do tampão de cacodilato de sódio e mergulhe-os em solução de tetróxido de ósmio a 2% por 4 h em temperatura ambiente. Esse processo é chamado de osmicação.
- Prepare a solução de tetróxido de ósmio a 2% seguindo as etapas abaixo.
- Para preparar a solução de tetróxido de ósmio a 2%, tome uma solução de tetróxido de ósmio a 4%, 4 mL (ver Tabela de Materiais), solução estoque de cacodilato de sódio 1 M (0,8 mL) e água destilada (3,2 mL) para perfazer um total de 8 mL de solução.
nota: Todo este processo e as etapas a partir daqui devem ser realizadas na hotte.
- Após a osmicação, mergulhe os tecidos em solução de acetato de sódio a 2% por 10 min em temperatura ambiente.
- Prepare a solução de acetato de sódio a 2% dissolvendo 4 g de acetato de sódio em 20 mL de água destilada.
- Em seguida, mergulhe os tecidos em solução de acetato de uranila a 2% por 1 h em temperatura ambiente.
- Prepare a solução de acetato de uranilo a 2% dissolvendo 4 g de acetato de uranilo em 20 mL de água destilada.
- Após a coloração com acetato de uranila, desidratar os tecidos sequencialmente através dos álcoois graduados e acetona na ordem mencionada na Tabela 2.
3. Incorporação de tecido cardíaco
- Incorpore os tecidos desidratados em resina epóxi de baixa viscosidade seguindo as etapas abaixo.
- Para fazer resina epóxi de baixa viscosidade, misture 10,24 mL de monômero epóxi de dióxido de ciclohexeno vinílico, 6,74 mL de éter diglicidílico de polipropilenoglicol (DER 732) e 30,05 mL de anidrido succínico nonenil (NSA) (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de 50 mL. Mexa bem a suspensão com a mão por 2 min.
- Adicione 18 gotas de acelerador epóxi de 2-dimetilaminoetanol (DMAE, consulte a Tabela de Materiais) e agite a suspensão para misturar bem os componentes.
- Impregnar os tecidos em resina epóxi na seguinte sequência de mistura.
- Substitua a acetona 100% por resina 1:1: suspensão de acetona e mergulhe os tecidos nela por 1 h em temperatura ambiente.
- Substitua a suspensão de resina 1:1: acetona por resina 6:1: suspensão de acetona e mergulhe os tecidos nela por 3 h.
- Por fim, substitua a suspensão de resina 6:1: acetona por suspensão 100% resina e deixe os tecidos imersos nela durante a noite em temperatura ambiente.
- Coloque os tecidos em resina fresca em micro moldes de 8 mm (ver Tabela de Materiais) e cure os tecidos embebidos a 70 °C durante a noite.
nota: Certifique-se de que a resina esteja dura, mas não quebradiça após a cura.
4. Seccionamento de tecido usando um ultramicrótomo
- Apare os blocos de resina com o tecido para não maiores que 1 mm antes de montar no ultramicrótomo (consulte a Tabela de Materiais). Coloque o molde com a maior precisão possível no braço segmentado do ultramicrótomo e avance manualmente o molde de amostra em direção à faca de diamante.
- Corte as seções com uma espessura de 500 nm (meio mícron) com uma faca Histo (consulte a Tabela de Materiais) e, usando a ferramenta de loop EM, pegue-as e coloque-as em uma lâmina de vidro.
- Coloque a lâmina de vidro em uma placa quente para mancha azul de toluidina para encontrar a área de interesse.
- Depois de encontrar a área de interesse, use uma faca Ultra 45° (consulte a Tabela de Materiais) para produzir seções ultrafinas de ouro pálido (100 nm). Coloque essas seções ultrafinas no lado opaco de uma grade de cobre de 200 mesh.
5. Coloração ultrafina de seção cardíaca
- Inicie a coloração desmascarando o antígeno usando uma solução de condicionamento, ou seja, solução de meta-periodato de sódio a 5%.
- Preparar 500 μL de solução de metaperiodato de sódio a 5% (ver Tabela de Materiais) em água destilada.
nota: Prepare uma solução fresca antes de usar.
- Coloque 20 μL de solução de metaperiodato de sódio em um filme de parafina limpo. Coloque as grades completamente secas com seções de tecido na gota da solução de condicionamento.
nota: O lado opaco da grade com a seção de tecido deve estar voltado para a solução de condicionamento.
- Deixar a grelha de corte na solução durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lave a seção de tecido gravada colocando-a sobre uma gota de água destilada por 60 s.
- Bloqueie os aldeídos residuais colocando as grades de seção em uma gota de solução de glicina 0,05 M por 10 min à temperatura ambiente. Seque as bordas da grade em papel de filtro para remover a solução de glicina residual.
- Prepare a solução de glicina 0,05 M (ver Tabela de Materiais) dissolvendo 3,75 mg de glicina em 1 mL de 1x PBS (pH 7,4).
- Coloque as grades de seção em 10-20 μL de solução de bloqueio por 25 min em temperatura ambiente.
nota: Composição da solução de bloqueio: 2 μL de soro de cabra normal a 1% (NGS) + 20 μL de BSA a 1% (concentração final: 10%) + 178 μL de PBS 1x (pH 7,4) para perfazer um volume final de 200 μL.
- Seque as bordas da grade em papel de filtro e coloque a seção da grade no diluente de anticorpos para condicionamento em temperatura ambiente por 10 min.
- Incube as seções da grade com anticorpo primário (Sigmar1 neste caso, consulte a Tabela de Materiais; diluído 1:10 em diluente de anticorpo) por 1 h 30 min em uma câmara umidificada.
- Seque a grelha e lave as secções da grelha com diluente de anticorpos duas vezes durante 5 min cada.
- Incubar as secções da grelha com anticorpo secundário biotinilado (neste caso, anticorpo secundário policlonal biotinilado de cabra anti-coelho, ver Tabela de Materiais; diluído 1:10 em diluente de anticorpos) durante 1 h numa câmara humidificada.
- Seque a grelha e lave as secções da grelha com diluente de anticorpos duas vezes durante 5 min cada.
- Incube as seções da grade em QD conjugado com estreptavidina disponível comercialmente (QD655 nm, consulte a Tabela de Materiais; diluído 1:10 em diluente de anticorpos) por 1 h em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Evite a exposição à luz cobrindo a câmara com papel alumínio.
- Seque as bordas da grade com papel de filtro e lave as seções da grade colocando-as em gotas de água por 2 min.
- Seque as bordas da grade para secar.
Tabela 1: Composição do PBS e outras soluções utilizadas para desidratação tecidual.
| buffer | composição | quantidade |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x) (1 L) | cloreto de sódio | 8 gramas |
| Cloreto de potássio | 0,2 g |
| Fosfato de sódio dibásico | 1,44 gramas |
| Fosfato de potássio monobásico | 0,24 g |
| Ajuste o pH para 7,4 | |
Tabela 2: Aplicação de álcool e acetona graduados para desidratação tecidual (Etapa 2.5)
| componente | Hora |
| 50% de etanol | 10 minutos |
| 70% de etanol | 10 minutos |
| Etanol 95% | 10 minutos |
| 100% etanol | 20 minutos |
| 100% etanol | 20 minutos |
| 100% acetona | 30 min |
| 100% acetona | 30 min |