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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparo animal e fixação renal
- Realize a fixação de perfusão seguindo as etapas abaixo.
- Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano (3%, 2,0 L / min) e administração intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,3 mg / kg), tartarato de butorfanol (5 mg / kg) e midazolam (4 mg / kg) (ver Tabela de Materiais).
- Perfundir o animal com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) e 30 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato (PB) através do ventrículo esquerdo do coração.
- Realize a fixação por imersão logo após a fixação da perfusão e amostragem renal.
- Mergulhe o rim em PFA a 4% a 4 °C por mais 16 h e, em seguida, lave-o com PBS por 2 h (três vezes)9 (Figura 1).
cuidado: O formaldeído e o paraformaldeído são irritantes tóxicos. Manusear os reagentes em uma hotte com equipamento de proteção individual adequado.
2. Descoloração e delipidação
- Prepare o CUBIC-L (Coquetéis de Imagem Cerebral/Corporal Clara e Desobstruída e Análise Computacional) para descoloração e delipidação consistindo em 10% em peso de Triton X-100 e 10% em peso de N-butileldietanolamina (consulte a Tabela de Materiais), seguindo relatórios publicados anteriormente.
- Realize a descoloração e deslipidação por CUBIC-L seguindo os passos abaixo.
- Mergulhe o rim fixo em 7 mL de 50% (v / v) CUBIC-L (mistura 1: 1 de água e CUBIC-L) em um tubo de fundo redondo de 14 mL (consulte a Tabela de Materiais) com agitação suave à temperatura ambiente por 6 h (Figura 2A). Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-L em um tubo inferior redondo de 14 mL com agitação suave a 37 ° C por 5 dias.
- Atualize o CUBIC-L todos os dias durante este processo. Após o processo de descoloração e deslipidação, lavar o rim com PBS em temperatura ambiente por 2 h (três vezes) (Figura 1). Use uma colher dispensadora para o manuseio da amostra (Figura 2B).
3. Coloração imunofluorescente de montagem total
- Prepare os tampões de coloração.
- Prepare o tampão de coloração para anticorpos primários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,5% de caseína em PBS e 0,05% de azida sódica.
- Prepare o tampão de coloração para anticorpos secundários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,1% de caseína em PBS e 0,05% de azida sódica.
- Realize a coloração com anticorpos primários.
- Imunomarque o rim deslipidado com anticorpos primários (1:100 ou 1:200, consulte a Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave por 7 dias.
nota: A quantidade do tampão de coloração necessária para um rim é de 500-600 μL (Figura 2C).
- Lave o rim com 0,5% (v / v) Triton X-100 em PBS (PBST) em temperatura ambiente por 1 dia (Figura 1).
- Realize a coloração com anticorpos secundários.
- Imunomarcar o rim com anticorpos secundários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias. Lave o rim com PBST em temperatura ambiente por 1 dia (Figura 1).
- Após a fixação, mergulhe o rim em formaldeído a 1% em PB (mistura 1:36 de formaldeído a 37% e PB) por 3 h e lave com PBS em temperatura ambiente por 6 h (Figura 1).
4. Correspondência do índice de refração (RI)
- Prepare o CUBIC-R+.
- Preparar o CUBIC-R misturando 45 % em peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina e 30 % em peso de nicotinamida (ver Tabela de Materiais).
- Prepare o CUBIC-R+ para correspondência do índice de refração (IR) adicionando 0,5% de N-butiledietanolamina ao CUBIC-R seguindo os relatórios publicados anteriormente.
- Execute a correspondência de RI.
- Mergulhe o rim em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-R+ (mistura 1:1 de água e CUBIC-R+) em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave em temperatura ambiente por 1 dia. Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-R+ em tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave em temperatura ambiente por 2 dias (Figura 1).
nota: Embora o rim flutue em 50% CUBIC-R+ no início da correspondência do IR, ele afunda e se torna transparente no CUBIC-R+ no final do processo (Figura 2D).
5. Aquisição e reconstrução de imagens
- Mergulhe o rim compatível com RI em uma mistura de óleo de silício (RI = 1,555) e óleo mineral (RI = 1,467) (55:45) durante a aquisição da imagem (RI = 1,51) (Figura 3).
- Adquira imagens 3D de todo o rim com um microscópio fluorescente de folha de luz personalizado (consulte a Tabela de Materiais). Colete todos os dados brutos da imagem em um formato TIFF de 16 bits. Visualize e capture as imagens renderizadas em 3D com o software de análise de imagens (Imaris, consulte Tabela de Materiais).
