Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto,
1. Coleta de biópsia de pele
- Deixe um médico qualificado realizar a biópsia de pele em um ambiente clínico apropriado.
- Escolha a área para realizar a biópsia de pele e limpe-a com um cotonete embebido em álcool.
- Preparar a solução anestésica com 1 cc de lidocaína a 2%.
- Com a agulha paralela à área, injete anestesia local por via subcutânea.
- Depois de verificar o efeito da anestesia, pegue o punção descartável de 3 mm e aplique pressão rotacional e delicada para baixo para girá-lo para baixo através da epiderme e derme, até que a gordura subcutânea seja alcançada.
- Retire o soco.
- Use uma pinça descartável para puxar suavemente o tampão da pele.
- Use uma tesoura para cortar a base da amostra ao nível do tecido adiposo.
- Coloque a amostra em um tubo contendo 10 mL de solução fixadora de periodato-lisina-paraformaldeído (PLP).
- Desinfete a área e cubra-a com um curativo adesivo.
2. Fixação e armazenamento de tecidos
- Faça uma solução fixadora PLP nova (consulte a Tabela 1).
- Imediatamente após a coleta da biópsia de pele, mergulhe-a em um tubo contendo 10 mL de solução fixadora de PLP e incube-a durante a noite (O/N) a 4 °C.
- No dia seguinte, sob a hotte, retirar o fixador PLP suavemente e no mesmo tubo, lavar a biópsia 3 vezes por 5 min com 5 mL de solução de Sorensen 0,1 M (Tabela 1).
- Rejeitar a solução de Sorensen e incubar a biópsia com 5 ml de solução crioprotetora O/N a 4 °C.
- Armazenar a biópsia a 4 °C se o corte com um criótomo for realizado dentro de 1 semana; armazenar a biópsia a -20 °C se o corte for realizado dentro de 3 meses; incorporar a biópsia em um criomoldor (etapas 3.2-3.4) e armazená-la a -80 °C para conservá-la por um longo período de tempo.
3. Corte de tecido com criotomo
- Definir o criótomo a -20 °C.
- Pegue um criomoldor e preencha-o com o meio de incorporação criogênica. Evite criar bolhas.
- Usando uma pinça, mergulhe a biópsia no meio de crio-incorporação com o eixo longitudinal (epiderme - derme) paralelo à parte inferior do criomolde.
- Congele a amostra com nitrogênio líquido para obter um cubo sólido de meio crio-incorporador contendo a biópsia na orientação correta.
- Coloque a amostra no criostato e aguarde 30 minutos para permitir que a biópsia se aclimate.
- Fixar a amostra no criostato e cortar secções de 50 μm.
- Com a ajuda de um pequeno pincel, transfira as crioseções em uma placa de 96 poços contendo 200 μL de solução anticongelante em cada poço. Uma seção por poço.
- Armazenar a -20 °C.
nota: Se a análise de toda a biópsia não for analisada, corte-a apenas parcialmente. Nesse caso, os cortes devem ser armazenados a -20 °C e a parte restante da biópsia a -80 °C para conservá-la por um longo período de tempo.
4. Coloração por imunofluorescência
- Encha uma placa de 96 poços, com 100 μL de solução de lavagem.
- Transferir os cortes a serem analisados da placa de armazenamento para a nova que contém a solução de lavagem. 1 corte por cada poço (4 cortes por sítio anatômico, por paciente: geralmente um total de 12 cortes por paciente).
- Deixe a seção na solução de lavagem por 10 min em temperatura ambiente (RT). Transfira a seção para outro poço contendo a mesma solução e repita a lavagem.
- Mova as seções para novos poços contendo 100 μL de solução de bloqueio e incube por pelo menos 90 min e por um máximo de 4 h em RT.
- Diluir os anticorpos primários anti-PGP9.5 (policlonal de coelho, 1:1000) e anti-5G4 (monoclonal de ratinho, 1:400) na solução de trabalho.
- Transferir as secções para novos alvéolos contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos primários e incubá-los O/N a RT.
- Como passo 4.3, lave as seções 2 vezes por pelo menos 10 min em RT, com 100 μL de solução de lavagem.
- Dilua os anticorpos secundários (conjugados com diferentes fluoróforos) Anti-coelho de cabra para detectar PGP9.5 (1:700) e um anti-Rato de cabra para detectar 5G4 (1:700) na solução de trabalho.
- Transferir as secções para novos alvéolos contendo 100 μL da solução de trabalho dos anticorpos secundários durante 90 min em RT. A partir deste ponto, cubra a placa de 96 poços com papel alumínio para evitar o branqueamento do fluoróforo conjugado com anticorpo(s) secundário(s).
- Como passo 4.3, lave as seções 2 vezes por pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
- Transfira as seções para novos poços contendo 100 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluído 1:5.000 em solução salina tamponada com fosfato [PBS] 1x) por 5 min em RT.
- Como passo 4.3, lave as seções 2 vezes por pelo menos 10 min, com 100 μL da solução de lavagem.
- Monte as seções em uma corrediça na posição correta, evitando dobras incorretas.
- Adicione algumas gotas do meio de montagem no slide e cubra com uma lamínula.
- Deixe as lâminas secarem O/N antes de usar o microscópio confocal/fluorescência.
- Armazene as lâminas em uma caixa apropriada a 4 °C, evitando a exposição à luz. Se armazenado com precisão, o sinal ficará visível por cerca de 6 meses.
nota: A transferência de uma seção da placa de 96 poços contendo as fatias recém-cortadas para a placa de 96 poços contendo a solução de lavagem (etapa 4.1) é realizada usando uma pequena escova que ajuda a pegar a biópsia. Após a transferência da seção para o primeiro poço, toda vez que a fatia precisar ser incubada com uma solução diferente, mova-a de um poço para outro com a ajuda do pincel.
5. Imagem de imunofluorescência
- Visualize seções sob um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal (ampliação de 20X, 40x ou superior, use quadros sucessivos de incrementos de 2 μm em um plano de pilha Z para obter melhores resultados).
- Adquira imagens por uma câmera conectada ao microscópio
- Use um software de imagem adequado (ou seja, ImageJ) para analisar sinais positivos em seções em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal. Para fazer isso, execute as etapas mencionadas abaixo.
- Abra o arquivo com o software ImageJ.
- Clique em Imagem > cor > dividir os canais para analisar cada canal de cor.
- Clique em Pilha de > de imagem > projeto Z para obter uma mesclagem de várias aquisições de seção.
- Clique em Imagem > canais de mesclagem de > de cores para obter uma mesclagem de diferentes canais de cores da mesma aquisição.
Tabela 1: Soluções necessárias. Lista de soluções necessárias para o protocolo e breve descrição de como prepará-lo.
Solução anticongelante
(armazenar a 4 °C por até 6 meses) | 30% de glicerol
30% de etilenoglicol
30% dH2O
10% 2x tampão fosfato |
Solução de bloqueio
(prepare-se no momento) | 4% Soro de Cabra Normal
1% Triton X-100
em Solução de lavagem |
Crioprotetor
(armazenar a 4 °C por até 6 meses) | 20% de glicerol
80% Solução de Sorensen |
Solução de hidrogenofosfato dissódico
(armazenar na RT até 6 meses) | Hidrogenofosfato dissódico 0,45M (Na2HPO4) em dH2O
Filtrar em frasco estéril |
Solução de lisina
(conservar a 4 °C até 3 semanas) | 50% de solução de monocloridrato de L-lisina 0,3M
50% da solução de Sorensen 0,1M pH 7,6
pH 7,4, filtro em frasco estéril |
Paraformaldeído (PFA) 8%
(preparar sob hotte e conservar a 4 °C até 1 mês) | 2,6M PFA em dH2O (a 55 ° C_do não exceder 60 ° C para evitar a formação de ácido fórmico)
Filtro em frasco estéril |
Tampão fosfato 2x
(armazenar a 4 °C por até 6 meses) | Solução de fosfato monossódico a 6% (NaH2PO4)
Solução de fosfato dissódico a 45% (Na2HPO4) em dH2O |
Solução fixadora PLP
(preparar no momento, sob a coifa) | 25% Paraformaldeído 8%
0,01M (meta)periodato de sódio
Solução de lisina a 75% |
Monohidrato de Dihidrogenofosfato de Sódio
(armazenar na RT até 6 meses) | 0,52M de Monohidrato de Dihidrogenofosfato de Sódio (NaH2PO4*H2O) em dH2O
Filtrar num frasco estéril. |
Solução de Sorensen
(armazenar a 4 °C por até 1 mês) | Solução de fosfato monossódico a 2,5%
Solução de fosfato dissódico a 18,7%
pH 7,6, em dH2O |
Solução de lavagem
(prepare-se no momento) | 0,25 M Trizma base
0,26 milhões de NaCl
pH 7,6, em dH2O |
Solução de trabalho
(prepare-se no momento) | Solução de bloqueio de 50%
Solução de lavagem a 50% |
