Usando tomografia mediada por fluorescência para avaliar a inflamação intestinal murina

Resumo

Fonte: Nowacki, T. M., et al. Tomografia mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação intestinal murina relacionada a macrófagos. J. Vis. (2017)

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a infiltração de macrófagos intestinais em um modelo murino de colite usando tomografia mediada por fluorescência (FMT). Ao induzir colite em um camundongo via sulfato de sódio dextrano (DSS), o animal é injetado com anticorpos que reconhecem o marcador de glicoproteína F4 / 80 em macrófagos infiltrados no cólon. O mouse é então fotografado em um dispositivo FMT, onde os sinais de fluorescência e refletância são reconstruídos em uma imagem tridimensional para determinar a distribuição espacial e a intensidade da fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Materiais e Configuração Experimental

1. Cuidados com os animais.
   1. Use camundongos pareados por sexo e idade de qualquer cepa suscetível a DSS (por exemplo, C57BL / 6) com 20-25 g de peso corporal.
   2. Planeje pelo menos cinco ou mais camundongos por grupo experimental e abrigue os camundongos de acordo com as diretrizes locais de cuidados com os animais.
   3. Forneça uma dieta padrão para ração para roedores e água potável autoclavada ad libitum.
   4. Remova a ração padrão e substitua-a por ração sem alfafa pelo menos três dias antes da varredura para reduzir a autofluorescência endoluminal.
2. Indução de colite aguda induzida por DSS.
   1. Dissolva 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) em 100 mL de água potável autoclavada para obter uma solução a 2% (p / v).
   2. Encha o suprimento de bebida dos camundongos exclusivamente com a solução DSS e estime 5 mL de líquido por camundongo por dia. Forneça a mesma água potável sem DSS para os camundongos controle.
      nota: Monitore os camundongos diariamente até o final do experimento. Eutanasiar os camundongos que perdem mais de 20% de seu peso corporal inicial ou que se tornam moribundos (ou seja, postura persistentemente curvada, diminuição do movimento, respiração difícil, pelagem marcadamente ereta) de acordo com as diretrizes locais aplicáveis sobre bem-estar animal.
3. Preparação de tomografia mediada por fluorescência.
   1. Rotule o anticorpo desejado (por exemplo, anti-camundongo de rato F4 / 80) com corante de fluorescência (por exemplo, cianina7,_{λ excitação}: 750 nm, λ_emissão: 776 nm) conforme descrito no protocolo do fabricante. Dialize o anticorpo purificado em uma membrana de diálise apropriada (tamanho dos poros < 50-100 kDa) contra 1 L de cloreto de sódio 0,15 M por pelo menos 2 h ou durante a noite.
      1. Transfira o anticorpo para 1 L de NaHCO₃ 0,1 M e dialise por pelo menos 2 h.
      2. Dissolva a quantidade necessária de corante fluorescente em dimetilsulfóxido (DMSO) (10,8 μL / mg de anticorpo) e adicione-o à solução de anticorpo. Use o corante fluorescente em excesso molar de 20 vezes para obter uma proporção de corante para proteína de 1:3.
      3. Incubar no escuro a 4 °C durante 1 h. Remover anticorpos não marcados por diálise contra 1 L de sódio 0,15 M ou utilizando uma coluna de dessalinização PD-10 e resolver em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para aplicação in vivo.
      4. Determine a concentração final de anticorpos e a proporção de marcação por espectrofotometria.
      5. Meça a concentração de proteínas em uma absorção de 250-330 nm e considere a absorção adicional pelo corante. Corrija a absorção máxima a 280 nm (proteína) em 11% da absorção máxima a 750 nm (próximo passo) para a marcação de cianina.
      6. Meça uma diluição do composto (normalmente 1:10) a 250-800 nm e extraia a concentração de cianina7 a 750 nm.
      7. Determine a proporção corante/proteína como: corante/anticorpo = absorção máxima a 750 nm / 200.000 / (absorção máxima a 280 nm - 0,11 x absorção máxima a 750 nm) / 170.000.
      8. Mantenha a solução de anticorpos a 4 °C e proteja-a da luz para evitar o branqueamento antes da injeção.
   2. Carregue o volume necessário da solução de anticorpos em uma seringa estéril imediatamente antes da injeção e proteja-a da luz até que seja usada.
   3. Determine o momento ideal da injeção da sonda e o procedimento de varredura, dependendo da farmacocinética do traçador.
   4. Anestesiar os camundongos usando isoflurano inalado a 1,5 a 2,5% em oxigênio ou colocá-los com segurança em um limitador dedicado para a injeção da veia da cauda dos anticorpos marcados.
   5. Para anticorpos de comprimento total, injete o anticorpo marcado pelo menos 24 h antes da varredura, como para visualização de macrófagos F4/80 anti-camundongo na colite murina. Injete camundongos por via intravenosa (i.v.) através da veia da cauda com anticorpo marcado em uma quantidade correspondente a 2,0 nmol de corante.
   6. Use anticorpos inespecíficos igualmente marcados (por exemplo, IgG de rato ou outro isotipo correspondente à herança primária de anticorpos) como um controle de isotipo em doses equivalentes às da sonda específica.
      nota: Os resultados das varreduras in vivo após a injeção do composto controle podem servir como referência para a interpretação dos dados específicos de imagem da sonda.
   7. Use um barbeador elétrico para raspar o pelo do animal na região abdominal para minimizar a reflexão e absorção de luz.

2. Equipamento Técnico

1. Use um dispositivo veterinário de tomografia mediada por fluorescência (FMT) para fluorescência de pequenos animais (Figura 1).
2. Crie um novo estudo para cada projeto clicando no botão "novo estudo" e inclua na descrição do estudo os traçadores relevantes, incluindo os parâmetros de imagem e doses para referência futura.
3. Dentro deste estudo, crie grupos de estudo de acordo com o respectivo desenho de estudo (por exemplo, para o traçador específico e controle de isotipo inespecífico) clicando no botão "novo grupo de estudo". Equipar cada grupo de estudo com o respectivo número de animais.
4. Calibre o sistema para as construções do rastreador.
   1. Realize a calibração para cada lote de traçadores para normalizar a variação na rotulagem e permitir a medição quantitativa a partir de dados de OI.
   2. Siga as orientações do fabricante do instrumento para a calibração de cada sistema individual; após a seleção de "adicionar novo traçador", o sistema fornecerá um guia através das etapas. Fornecer a diluição da solução de anticorpos aplicada e a concentração absoluta calculada do marcador na sonda.
   3. Para FMT, use um simulador de tecido com espessura e características de absorção definidas (semelhante ao tecido vital) e preencha-o com um volume específico da solução de anticorpos usada. Meça isso no dispositivo FMT.
      nota: O sistema utilizará a medição de referência da sonda fornecida, juntamente com a concentração indicada, para calcular as concentrações absolutas do traçador a partir de futuras medições in vivo.
5. Utilizar uma de exame aquecível com uma temperatura de 42 °C.
   nota: Isso evita que os camundongos fiquem hipotérmicos durante o exame.

3. Anestesia Animal

1. Use um fluxo contínuo de 1,5 - 2% vol% isoflurano ([2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoroetano]) e 1,5 L O₂ / min para anestesiar os camundongos. Use sistemas de inalação especialmente projetados para anestesia de roedores (vaporizador de isoflurano) para controlar facilmente a profundidade do anestésico e minimizar a exposição da equipe.
2. Coloque o mouse na câmara de indução à prova de vazamentos e ligue o vaporizador para fornecimento de isoflurano (100% (v/v), 5 vol% em oxigênio, 3 L/min). Monitore o mouse até que ele esteja deitado e inconsciente.
3. Coloque-o no de exame para tomografia, com inalação contínua de isoflurano via cone nasal na dose de 100% v/v, 1,5 vol% em oxigênio, 1,5 L/min para minimizar artefatos de movimento durante o exame. Para procedimentos que duram mais de 5 minutos, aplique pomada ocular nos olhos do camundongo para evitar danos à córnea.
4. Avalie a profundidade do anestésico verificando os reflexos. Coloque o mouse de costas; Se a anestesia for suficiente, o mouse não deve se virar. Aperte o mouse suavemente entre os dedos dos pés; Se a anestesia for suficiente, a perna não será retirada (estágio de tolerância cirúrgica).

4. Tomografia mediada por fluorescência

NOTA: Adapte os seguintes detalhes, que são específicos para o sistema FMT usado neste estudo (consulte a Tabela de Materiais) para dispositivos alternativos de imagem de refletância de fluorescência ou sistemas FMT, conforme necessário.

1. Coloque o mouse anestesiado de costas no de exame.
2. Execute o procedimento de digitalização.
   1. Insira o no sistema de imagem e feche-o imediatamente para garantir uma anestesia contínua. Selecione a amostra apropriada do grupo de estudo criado anteriormente. Selecione o rastreador administrado no menu suspenso para garantir que os valores da concentração do traçador sejam calculados corretamente.
   2. Adquira a imagem de refletância de fluorescência no comprimento de onda apropriado (720 nm para Cyanine7) para o planejamento da varredura e contorne o campo de varredura clicando no botão "adquirir imagem".
   3. Veja se o campo de varredura aparece como uma sobreposição na imagem de refletância de fluorescência. Ajuste-o à região de interesse (por exemplo, cólon ou abdômen), evitando ar ou áreas de pêlo remanescente. Dependendo do destino da imagem, defina o número de pontos de dados da imagem dentro do campo de varredura escolhendo entre a resolução do campo de varredura grosseira para média e fina no menu à direita.
      nota: Lembre-se de que um campo de varredura fino pode oferecer melhor resolução espacial ao custo de um tempo de varredura significativamente mais longo.
   4. Inicie a aquisição de dados/imagem no comprimento de onda selecionado clicando em "scan."
      nota: O tempo de varredura para uma varredura média-fina de todo o abdômen será de cerca de 5 min; Nesse tempo, cada ponto de dados é iluminado separadamente pelo laser de excitação e a fluorescência resultante é registrada.
   5. Remova o animal do de imagem no final do exame e deixe-o se recuperar completamente antes de colocá-lo de volta na gaiola.
   6. Repita o FMT se considerado necessário em vários momentos durante o experimento (por exemplo, dias 0, 5 e 9 - 10 (final do experimento)), mas considere o acúmulo de anticorpos no corpo, aumentando assim o sinal de fluorescência de fundo.

5. Reconstrução e interpretação dos dados

1. Use a ferramenta de reconstrução do respectivo software de imagem para criar mapas 3D da distribuição de fluorescência a partir dos dados brutos de imagem; as varreduras são adicionadas automaticamente à ferramenta de reconstrução quando, após a digitalização, a função "adicionar à fila de reconstrução" é selecionada.
   1. Caso contrário, selecione as digitalizações no menu suspenso no respectivo estudo e grupo de estudo, clique com o botão direito do mouse na digitalização e selecione "adicionar à reconstrução".
2. Para análise posterior, carregue um conjunto de dados no software de análise. No menu suspenso na barra superior, selecione o respectivo estudo e, em seguida, selecione o grupo de estudo e o animal individual no menu à direita; Todas as varreduras realizadas para este animal serão mostradas. Selecione a varredura correta e clique em "carregar"
   nota: A reconstrução 3D da distribuição do traçador aparecerá à esquerda como uma sobreposição da imagem de refletância de fluorescência inicialmente adquirida. O modelo pode ser girado e ampliado para facilitar a análise.
3. Identifique focos de acúmulo de rótulos inespecíficos (por exemplo, fígado ou bexiga urinária) em mapas 3D reconstruídos e diferencie dos tecidos-alvo (por exemplo, intestino ou intestino).
4. Na barra superior, selecione a forma de ROI mais apropriada para o destino. Rotule o tecido-alvo como regiões de interesse (ROI), colocando as respectivas ferramentas de medição no software de análise; o software fornecerá uma intensidade de fluorescência para o ROI, bem como quantidades (pico-)molares do traçador para o qual a varredura foi calibrada.
5. Selecione a quantidade total de traçador na ROI apropriada, normalizada para o tamanho da ROI, como o equivalente mais adequado para a avaliação da atividade da doença em correlação com o infiltrado inflamatório (histologia).
   nota: Outras características do ROI podem ser escolhidas, se apropriado, como representativas do modelo específico.

Resultados

Figura 1. Visualização tomográfica de infiltrados de macrófagos na colite murina.

FMT em camundongos colíticos e controles não colíticos administraram anticorpo conjugado com cianina7 contra o murino F4/80 (n = 5 por grupo). (A) Gráfico de barras: a intensidade total de fluorescência em pmol de corante foi determinada no ROI e representada ± ME...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Dieta sem alfafa	Harlan Laboritories, Madison, EUA	2014
Pomada para os olhos Bepanthen	Bayer, Leverkusen, Alemanha	80469764
Sulfato de dextrano sódico (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Suécia	DB001
Eosina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	E 4382
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Alemanha	B506
Haematoxylin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	HHS32-1L
Composto O.C.T. Tissue Tek	Sakura, Zoeterwonde, Países Baixos	Nº 4583	fixador para análises histológicas
Solução salina tamponada com fosfato, PBS	Lonza, Verviers, Bélgica	Nº 4629
Cloreto de sódio 0,9%	Braun, Melsungen, Alemanha	12211095/05/0411
Bicarbonato de sódio em pó	Sigma Aldrich Deisenhofen, Alemanha	S5761
Dieta padrão	Altromin, Lage, Alemanha	1320
Tecla-Tecido Cryomold	Sakura, Leiden, Países Baixos	Nº 4566
Hemoccult (teste de papel guaiaco)	Beckmann Coulter, Alemanha	3060
Biotina rat-anti-mouse anti-F4/80 anticorpo	Serotec, Oxford, Reino Unido	MCA497B
Biotina rato-anti-rato anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha	553125
Streptavidin-Alexa546	Sondas Moleculares, Darmstadt, Alemanha	S-11225	Excitação/emissão máxima: 556/573nm
Anticorpo anti-rato-camundongo anti-CD11b TC	Calteg, Burlingame, EUA	R2b06
Anticorpo anti-camundongo F4/80 purificado	BioLegend, Londres, Reino Unido	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	D9542
Anticorpo anti-Ly6C rato-anti-camundongo conjugado com FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha	553104
Buffer FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, Alemanha	342003
Cy7 NHS Éster	GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemanha	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemanha	K 6631B
Anticorpo anti-rato F4/80 marcado com Cy5.5	BioLegend, Londres, Reino Unido	123127	Anticorpos marcados prontos a utilizar (alternativa)
Anti-Camundongo F4/80 Antígeno PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, EUA	45-4801-80	Anticorpos marcados prontos a utilizar (alternativa)
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	67-68-5
Isoflurano	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	792632
etanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	64-17-5
Albuminas de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	Rolamento A4612
Solução salina tamponada Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	SRE0032
equipamento
Sistema de citometria de fluxo FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Alemanha
FMT 2000 Sistema de Imagem In Vivo	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUA	FMT2000
Software de análise de imagem True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUA	incluído no FMT2000
Microscópio fluorescente Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, Alemanha	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlim, Alemanha	HD 2070	homogeneizador ultrassônico
Bisturi descartável nº 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	Z692395-10EA
Tesoura Metzenbaum 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Alemanha	22398330
Seringa Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	Z248010
agulhas de seringa	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemanha	Z192368
Falcão Tubo 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica	Rolamento 352070