Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Design de layout e produção de matriz personalizada
- Gere uma planilha de sequências de peptídeos com chamadas de alelos correspondentes. A matriz tem 20 linhas e 30 colunas e pode conter até 20x30 = 600 pontos para peptídeos. Dependendo do número total de peptídeos registrados na etapa 1.5 de um doador específico, e com base em nossa experiência anterior com dois exemplos que tentamos, a matriz de 600 pontos pode conter todas as sequências geradas a partir de ~ 2 casos de transplante separados.
- Planeje racionalmente a maneira mais eficiente de encaixar os conjuntos de peptídeos no formato de 600 pontos da matriz.
- Se mais de um assunto puder caber em uma matriz inteira, insira linhas vazias após as sequências do primeiro doador para corresponder ao número total de linhas que podem ser divididas por 30 (o número de pontos em uma linha na matriz).
- Imediatamente após a última linha vazia para o primeiro conjunto de sequências, cole toda a coluna de conteúdo da sequência do segundo caso de transplante.
- Repita essas etapas até que a matriz seja preenchida e nenhum outro caso possa ser adicionado sem exceder os 600 pontos. Se linhas vazias inteiras forem deixadas para preencher na parte inferior, "mova" a linha vazia para ser posicionada entre os dois conjuntos de doadores. Este amplo espaço deixado entre os casos facilita o corte da membrana após a conclusão da síntese - seguindo o passo 2.2. abaixo.
- Programe as sequências de peptídeos no contexto do layout da matriz. O programa do sintetizador SPOT assume um formato de texto das sequências (uma linha, uma sequência de peptídeos), que pode ser obtido diretamente salvando a planilha resultante da etapa 1.1.4 como um documento de texto simples (sem a(s) coluna(s) extra(s) para nomes de alelos, posições aa etc.).
- Execute a síntese automatizada de matriz de peptídeos por meio do sintetizador SPOT. Toda a operação da síntese é detalhada em Kudithipudi et al. Observe que a síntese Fmoc de duas matrizes leva ~ 4-5 dias.
2. Sonda e anti-soros de reprova de uma série temporal de um receptor de transplante individual.
NOTA: A matriz de membrana de 600 pontos tem as dimensões ~7 cm x 13 cm. Após a síntese, as matrizes podem ser armazenadas em temperatura ambiente como membranas secas por pelo menos dois anos quando protegidas da luz direta. Evite dobras excessivas da membrana para preservar sua longevidade para uso repetido.
- Reidrate a matriz de membranas com etanol e visualize manchas peptídicas coradas com Ponceau S.
- Reidrate a matriz de membrana que transporta os peptídeos seguindo um procedimento gradual otimizado em Li et al.
- Mergulhe a membrana da matriz em 20 mL de etanol 100%.
- Adicione 20 mL de água destilada para diluir a solução a 50% de etanol e incube em temperatura ambiente por 15 min.
- Troque a solução de imersão para 40 mL de água 100% três vezes e incube 15 min de cada vez.
- Lave em um tampão de trabalho adequado, por exemplo, 20 mL de TBST (solução salina tamponada com Tris com 0,1%), três vezes por 5 min cada.
- Coloração Ponceau S da matriz para visualização de peptídeos sintéticos
- Adicione 20 mL de solução pré-formulada de Ponceau S diretamente à matriz hidratada e incube por ~ 30 s com agitação.
- Passe água destilada continuamente sobre a membrana para desmanchar a cor de fundo Ponceau S. Durante o processo, manchas peptídicas de cor vermelha podem se tornar visíveis.
- Separe as partes da matriz para cada doador, cortando cuidadosamente entre as seções da matriz para casos individuais. Marque a orientação de cada matriz.
- Matriz de pré-bloco.
- Bloqueie a membrana em 20 mL de leite desnatado a 5% dissolvido em tampão TBST. Esta solução à base de leite irá desmanchar ainda mais a cor Ponceau S. Substitua o tampão de leite várias vezes para obter as imagens peptídicas mais claras.
- Para fins de manutenção de registros, tire uma foto da imagem Ponceau S da matriz usando uma câmera portátil (exemplo na Figura 1).
- Continue bloqueando a membrana em leite desnatado a 5% a 4 ° C durante a noite ou em temperatura ambiente por 2 h com balanço.
- Incube a matriz com anti-soro de transplante.
nota: Deve-se notar que um fenômeno conhecido como prozona ou efeito Hook pode resultar da interferência dependente do complemento na análise de anticorpos séricos. Para contornar esse problema, uma etapa opcional de pré-tratamento sérico pode ser considerada com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou inativação por calor de amostras de soro.
- Remova o tampão de bloqueio e lave a membrana com 20 mL de TBST três vezes no dia seguinte por 5 minutos de cada vez.
- Adicione 20 μL do soro bruto do receptor a 20 mL de leite a 2,5% em tampão TBST e incube com a membrana por 2-3 h em temperatura ambiente. Observe que, nesta rodada inicial de sondagem, recomenda-se que o último soro pós-transplante (ou soro provavelmente mais sensibilizado) da série temporal seja usado primeiro. Isso se baseia na suposição de que os espécimes anteriores da série, particularmente de pontos de tempo pré-transplante, têm menos variedade de aloanticorpos que tendem a se desenvolver ao longo do tempo. Dessa forma, qualquer possibilidade de interferência de sinal de "transferência" entre as rodadas de sondagem pode ser claramente distinguida da reatividade de aloanticorpos verdadeiramente desenvolvida devido às respostas imunes contra o enxerto.
- Lave a matriz usando 20 mL de TBST e incube-a com um anticorpo secundário.
- Lave a membrana três vezes por 10 minutos de cada vez.
- Incubar com anticorpo secundário IgG-HRP (peroxidase de rábano) anti-humano de cabra na diluição de 1:10.000 em tampão TBST suplementado com 1% de leite por mais 2 h.
- Lave e revele a mancha.
- Lave a membrana três vezes com TBST por 10 min de cada vez.
- Realize quimioluminescência aprimorada (ECL) usando 5 mL de solução de luminol recém-misturada com 5 mL de solução de peróxido para desenvolver a membrana (por 1 min).
- Visualize sinais de ECL usando um gerador de imagens adequado (ou seja, ChemiDoc Imaging Systems ou Azure C600).
- Digitalize e quantifique o blot.
- Salve as imagens reveladas (Figura 2, imagem inferior) e faça a quantificação da intensidade do ponto.
3. Compare a reatividade anti-soro em uma série temporal clínica.
- Retire a matriz.
- Neste ponto, mantenha a membrana molhada o tempo todo.
- Descasque a membrana incubando com 20 mL de tampão de decapagem comercial a 37 ° C por 20 min e, em seguida, lave a membrana com TBST três vezes por 10 min cada. Em seguida, repita as etapas de bloqueio (etapa 3.2) e sondagem (etapa 3.3) usando um soro diferente do paciente tomado em um ponto de tempo diferente.
- Bloco de membrana descascada.
Nota: Após a decapagem, a membrana pode ser reutilizada para outra rodada de sondagem de um soro diferente do mesmo paciente em uma série temporal.
- Bloqueie a membrana usando tampão de leite a 5% como antes (consulte a etapa 2.2).
- Reprove um anti-soro diferente da mesma série temporal (repita as etapas de 2,3-2,6; exemplo na Figura 2, imagem superior).
nota: A matriz despojada pode então ser usada para reprover outra amostra de soro. Como os peptídeos são conjugados covalentemente à matriz de suporte da membrana, mostramos que a matriz pode ser reutilizada por até 20 rodadas de ciclos de decapagem e resondagem sem perder seu desempenho.
