Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

Resumo

Fonte: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertório of Circulating Anti-carboidratoJ. Vis. Exp.(2019)

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Produção de glicochips

1. Preparação de microarray
   1. Imprima os glicanos (50 mM) e polissacarídeos (10 μg / mL) em solução salina tamponada com fosfato 300 mM (PBS, pH 8,5) em 6 repetições em lâminas de vidro derivatizadas de N-hidroxisuccinimida, usando um array robótico sem contato (volume de gota ~ 900 pL). Cada slide contém 4 blocos diferentes de sub-arrays (Figura 1A, em cores) repetidos 6 vezes. Cada sub-array é formado por 112 pontos diferentes de glicanos, incluindo controles (8 linhas × 14 colunas) (Figura 1B).
      nota: As informações relacionadas ao glicano são fornecidas na Tabela 1. A biblioteca de glicanos usada para imprimir microchips é o resultado de um esforço sintético de longo prazo da equipe do IBCh; Exemplos de síntese são descritos em publicações relacionadas. A biblioteca de glicanos incluía antígenos de grupos sanguíneos e alguns dos oligossacarídeos terminais mais frequentes, bem como motivos centrais de glicoproteínas e glicolipídios ligados a N e O de mamíferos, antígenos de carboidratos associados a tumores e polissacarídeos de bactérias patogênicas.
   2. Incubar as lâminas numa caixa de humidade (humidade relativa ~70%) à temperatura ambiente (25 °C) durante 1 h.
   3. Microarrays de bloqueio: incubar as lâminas por 1,5 h com tampão de bloqueio à temperatura ambiente (ácido bórico 100 mM, etanolamina 25 mM, Tween-20 0,2% (v/v) em água ultrapura).
   4. Lave o glicochip com água ultrapura e seque-o ao ar.
2. Controle de qualidade Glycochip
   1. Analise dois microarrays de cada lote usando solução de 1 mg/mL de preparação de imunoglobulina complexa (CIP, contendo imunoglobulina: IgG, IgM e IgA), solução de 10 μg/mL de imunoglobulinas anti-humanas biotiniladas de cabra como anticorpo secundário (IgM + IgG + IgA), seguido por 1 μg/mL de solução do conjugado de estreptavidina fluorescente correspondente (via protocolo descrito abaixo, consulte a etapa 2).
   2. Digitalize e analise os glicochips (consulte a etapa 3, análise da matriz de glicanos).
   3. Use lotes de microarray com correlação intra e inter-chip superior a 0,9.

2. Técnica de Matriz de Glicanos

1. Preparar as seguintes soluções aquosas (em água ultrapura) e conservá-las à temperatura ambiente (25 °C):
   1. Tampão-1: albumina sérica bovina (BSA) a 1% (p/v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), Tween-20 a 1% (v/v) e azida sódica (NaN₃) a 0,01% (p/v).
   2. Tampão-2: 1% (p/v) BSA em PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) NaN₃.
   3. Tampão-3: 0,1% (v/v) Tween-20 em PBS.
   4. Tampão-4: 0,001% (v/v) Tween-20 em PBS.
2. Glicochip e preparação de amostras
   1. Coloque a caixa de armazenamento com as lâminas sobre a mesa até que atinjam a temperatura ambiente (25 °C).
      nota: Use luvas de látex sem pó. O glicochip deve ser manipulado pela parte inferior da lâmina de vidro, onde está localizado o código de barras. O código de barras ajudará você a identificar o lado direito, evitando o contato com a superfície onde os glicanos são impressos.
   2. Abra a caixa, pegue o glicochip e coloque-o na câmara de incubação (25 °C), já acondicionado com papel de filtro úmido para manter a umidade constante dentro da câmara.
   3. Enquanto isso, dilua o soro de camundongos com Tampão-1 (1:20) em tubos de 1,5 mL. Homogeneizar a solução de soro (5 s) com um misturador de vórtice.
      nota: O volume necessário para cobrir totalmente uma única superfície de glicochip é de aproximadamente 1 mL.
   4. Após a homogeneização, incubar o soro diluído a 37 °C por 10 min em banho-maria para evitar a agregação de imunoglobulinas. Centrifugar os tubos durante 3 minutos a 10.000 x g e a 25 °C, recolher o sobrenadante e rejeitar qualquer material precipitado.
   5. Coloque o glicochip cuidadosamente na câmara de incubação. Incube-o por 15 min a 25 ° C com 1 mL de Tampão-3 para eliminar qualquer material residual na superfície do glicochip.
   6. Segure o glicochip na posição vertical e lave-o novamente com algumas gotas de Tampão-3 usando uma pipeta de plástico Pasteur. Remova cuidadosamente o tampão da superfície do glicochip usando papel de filtro.

3. Reacção: ligação de anticorpos

1. Coloque o glicochip na câmara de incubação. Espalhar a amostra de soro diluído sobre a superfície do glicochip com uma micropipeta. Incubar com agitação orbital (30 rpm) a 37 °C durante 1,5 h. Certifique-se de que toda a área seca da superfície do glicochip seja coberta pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta.
2. Remova qualquer excesso de sample e mergulhe o glicochip por 5 min em Buffer-3 a 25 °C. Em seguida, mova o glicochip para um recipiente com Tampão-4 (5 min) e, finalmente, lave (5 min) o glicochip com água ultrapura. Centrifugue o glicochip por 1 min a 175 x g e 25 °C para remover o líquido.

4. Detecção: anticorpo secundário

1. Coloque o glicochip na câmara de incubação. Espalhe sobre a superfície do glicochip uma solução (5 μg/mL) de cabra anti-camundongo (IgG + IgM) conjugada à biotina em Buffer-2. Incubar com agitação orbital (30 rpm) a 37 °C durante 1 h.
2. Remova a fração não ligada e repita as etapas de lavagem.
3. Após a centrifugação, incubar o glicochip na escuridão a 25 °C durante 45 min (30 rpm) com 2 μg/ml da solução de estreptavidina marcada com fluorocromo correspondente (em Tampão-2).
4. Na escuridão, remova a fração não ligada e repita as etapas de lavagem.
5. Seque o glicochip ao ar.
   nota: O glicochip deve ser escaneado o mais rápido possível. Mas se for impossível fazer a varredura imediatamente após a coloração, os glicochips podem ser armazenados em um local fresco e seco no escuro.

3. Análise da matriz de glicanos

1. Verificar a matriz
   1. Deixe o glicochip sobre a mesa até atingir a temperatura ambiente no escuro. Ao mesmo tempo, ligue o scanner de lâminas e o laser (comprimento de onda de excitação de 633 nm).
   2. Segurando o microarray, deslize o glicochip no slot até que ele toque a parte de trás.
   3. Digitalize o glicochip ("execute a verificação fácil") e salve a verificação como um ". TIFF".

Tabela 1: Lista de glicanos, sua ligação aos anticorpos circulantes naturais (IgM + IgG) de camundongos BALB/c (n = 20), expressa em unidades de fluorescência relativa (RFU) como mediana ± MAD, e o número de animais que excedem o ponto de corte (≥4000 RFU). Esta tabela foi reproduzida de Bello-Gil, D. et al. Clique aqui para baixar esta tabela.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática (não em escala) da configuração, impressão e análise da matriz de glicanos.(A) Os microchips impressos são desenvolvidos com uma biblioteca de 419 estruturas diferentes de glicanos, seguida pela detecção com um anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado. Cada slide contém 4 blocos diferentes de sub-arrays (em cores), repetidos 6 veze...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos
Igs anti-humanos de cabra biotinilada	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	Referência: #: 31782
IgM + IgG anti-camundongo de cabra biotinilada	Thermo Fisher Científico	Referência: #: 31807
equipamento
Robô Arrayer sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlim, Alemanha	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Bandeja de manchas (câmara de incubação de lâminas)	Simport, Beloeil, QC, Canadá	Referência #: M920-2
centrifuga	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	Referência #: 5810 R
Pipetas	Gilson, Middleton, WI, EUA	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Scanner de slides	PerkinElmer, Waltham, MA, EUA	ScanArray GX Plus
Incubadora de agitação	Cole-Parmer, Staffordshire, Reino Unido	Ref. #: SI50
Amostras biológicas
Soro de camundongos BALB/c	Este artigo	N/A
Preparação de imunoglobulina complexa (CIP)	Immuno-Gem, Moscou, Rússia	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Produtos Químicos, Reagentes e Glicanos
Biblioteca de glicanos	Instituto de Química Bioorgânica (IBCh), Moscou, Rússia	N/A
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Referência: #: A9418
etanolamina	Sigma-Aldrich	N° #: 411000
Interpolação-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Espanha	Ref. #: 655204
Solução salina tamponada com fosgote (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Espanha	Referência #: E404
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugado	Thermo Fisher Científico	Referência #: S21381
Conjugado de estreptavidina Cy5	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido	Ref. #: PA45001
materiais
Corrediças de vidro derivatizadas de N-hidroxisuccinimida H	Schott-Nexterion, Jena, Alemanha	Ref. #: 1070936
Papel de filtro Whatman	Sigma-Aldrich	Ref. #: WHA10347509
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	Ref. #: 0030120086
Software e algoritmos
Sistema de análise de microarray ScanArray Express	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray