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1. Projetando o layout do slide da matriz e da placa de origem
- No cabeçalho 'Planejar um layout de slide' na interface do ArrayNinja, clique no link que corresponde à impressora de microarray que está sendo usada.
nota: O ArrayNinja foi programado para imitar o movimento robótico de duas impressoras de microarray comumente usadas (consulte a Tabela 1). A compatibilidade com os outros arrayers pode ser configurada mediante solicitação.
- Clique dentro da caixa de diálogo 'Placa de carregamento', digite "vazio" e clique em 'enter'. Consulte a Figura 1 para obter uma captura de tela do módulo de design do ArrayNinja.
- Ajuste o diâmetro do ponto para 275 μm e o espaçamento do ponto para 375 μm. Ajuste as configurações restantes (Blocos de placas/linha de placas, Total de linhas de placas, réplicas, recursos em y, Super Arrays, fudge SuperA; consulte a Figura 1) para personalizar como os recursos aparecerão no slide de microarray.
nota: O diâmetro do ponto é determinado pelo tamanho do pino do microarray. À medida que essas configurações são ajustadas, o slide de desenho animado será atualizado em tempo real. Use este desenho animado para visualizar como cada configuração está modificando o layout final do slide.
- Após a finalização do layout das feições no slide, passe o mouse sobre cada feição exclusiva e insira o identificador da feição na caixa de diálogo pop-up.
nota: Os identificadores de recursos podem consistir em números, letras ou combinações. Isso é necessário somente para recursos exclusivos e uma caixa de diálogo não aparecerá quando as réplicas forem selecionadas.
- Depois que todos os recursos exclusivos receberem um identificador, clique em 'preencher'. Digite um nome para o layout do slide e clique em 'imprimir seu prato' para salvar. Uma nova página será aberta exibindo o número de placas de origem de 384 poços necessárias para fabricar o design de lâmina escolhido e uma tabela mapeando a localização física de cada feição a ser carregada na(s) placa(s) de origem.
nota: Lembre-se deste nome, pois ele será usado para lembrar este design ao analisar dados de microarray. Clicar em 'imprimir sua placa' salva o layout no ArrayNinja.
2. Fabricação de Microarrays
- Preparando a placa de origem
- Use o mapa gerado com o ArrayNinja para criar a(s) placa(s) de origem de 384 poços.
NOTA: Descrições detalhadas dos peptídeos consultados nesta plataforma podem ser encontradas em outro lugar.
- Deposite 1 - 2 μL de cada característica (por exemplo, peptídeo de histona biotinilada) no poço correto da(s) placa(s) fonte(s) de 384 poços).
nota: Os peptídeos de histonas biotiniladas são normalmente depositados a partir de soluções estoque de 200 a 400 μM, o que equivale a um excesso molar de 10 a 25 vezes do peptídeo aos locais de ligação da estreptavidina em um único ponto de matriz. Isso é calculado usando a equação:
onde V é o volume entregue por um pino, [P] é a concentração do recurso que está sendo impresso, NA é o número de Avogadro e S é a área de superfície de um ponto. C é a cobertura da lâmina, expressa como o número de moléculas de estreptavidina por unidade de área multiplicado por três (o número médio de sítios de ligação de estreptavidina disponíveis). V e C são obtidos pelo respectivo fabricante. Outras características podem exigir concentrações diferentes, dependendo do tamanho da biomolécula, onde a aglomeração pode ser uma preocupação. Uma faixa de concentrações de impressão para cada novo tipo de recurso deve ser testada empiricamente para determinar a concentração de impressão ideal.
- Dilua cada recurso 10 vezes com 1x tampão de impressão suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1%. Gire a(s) placa(s) de origem a 500 x g por 2 min em temperatura ambiente.
nota: A inclusão de biotina marcada com fluoresceína (5 μg/μL) no tampão de impressão é recomendada como controle de manchas e como auxílio visual para facilitar o alinhamento adequado da matriz durante a análise (consulte a Figura 3).
- Protocolo de impressão (Figura 2A – B).
- Prepare o aparador esvaziando o recipiente de coleta de resíduos e enchendo o recipiente da solução de lavagem e o recipiente do umidificador com água destilada estéril.
- Insira os parâmetros usados para projetar o slide no ArrayNinja (Figura 1) no programa de controle da impressora de microarray.
- Usando o programa de controle da impressora de microarray, defina o procedimento de lavagem para uma lavagem de 1 s com uma imersão. Defina as configurações de pós-lavagem para mergulhar novamente os pinos 5 vezes após cada lavagem. Defina a umidade para 60%.
nota: A configuração de lavagem ideal pode variar dependendo da impressora de microarray que está sendo usada. A configuração ideal de imersão de pinos pós-lavagem pode variar dependendo da impressora de microarray que está sendo usada.
- Insira lâminas funcionalizadas (por exemplo, vidro revestido com estreptavidina) nas placas do substrato e coloque todas as placas no elevador de placas. Insira a(s) placa(s) de origem no(s) suporte(s) da placa e coloque-a no elevador da placa de origem.
- Clique em 'imprimir'. Monitore o processo de impressão para algumas rodadas de deposição de recursos para garantir que todas as configurações de lavagem e imersão estejam corretas. Quando a execução da impressão estiver concluída, remova as placas de substrato do arrayer.
nota: Quando grandes tiragens proíbem a conclusão das etapas de bloqueio dentro de um dia, as lâminas impressas podem ser incubadas em uma câmara umidificada a 4 °C durante a noite. Incube as lâminas ao lado de um pequeno copo de água dentro de uma caixa de papelão selada com filme plástico.
- Bloqueie as lâminas com tampão de bloqueio por 30 min em temperatura ambiente com mistura.
- Lave as lâminas 2 x 10 min em temperatura ambiente em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,6 com mistura. Seque as lâminas girando em uma centrífuga de lâminas de microarray por 30 s em temperatura ambiente.
nota: Para processar um grande número de lâminas de uma só vez, uma câmara de lavagem de lâminas de microscópio de alto rendimento pode ser usada, permitindo que 50 lâminas sejam lavadas em paralelo.
- Para lâminas projetadas para serem particionadas com cera, vá para a seção 2.1. Para todos os outros modelos, armazene as lâminas a 4 °C protegidas da luz e da umidade.
nota: Os peptídeos de histonas biotinilados impressos são estáveis por pelo menos 6 meses quando armazenados dessa maneira.
2. Particionamento de slides de microarray
- Caneta de cera hidrofóbica (Figura 2C)
- Aplique cera ao redor das áreas que contêm recursos usando uma caneta de cera. Deixe a cera secar ao ar por 5 min antes de prosseguir para a seção 3.
nota: Após o bloqueio, os pontos da matriz podem ser muito difíceis de visualizar a olho nu. O design do slide da ArrayNinja pode ser impresso em escala e usado como guia para a aplicação de cera.
- Junta de silicone (Figura 2D)
- Retire o filme transparente da parte de trás da junta da matriz e coloque o lado adesivo para baixo na lâmina do microarray.
- Segure a junta no lugar por 5 s antes de prosseguir para a seção 3.
- Impressão de cera (Figura 2E)
- Para lâminas projetadas para serem particionadas por cera, imprima uma lâmina de teste em vidro comum usando 10% BSA. Use este slide de teste para otimizar as guias da impressora de cera ou as configurações da matriz para garantir que todos os recursos estejam dentro das câmaras do molde de cera.
- Aqueça a impressora de cera de microarray a 85 °C até que toda a cera esteja completamente derretida, aproximadamente 30 min.
- Insira o slide com o lado impresso voltado para baixo e empurre o slide até a guia direita na impressora de microarray. Puxe a alavanca para colocar o molde em contato com a superfície da corrediça. Segure por 2 s.
nota: O tempo de espera pode ser alterado para obter a espessura ideal da borda de cera.
- Remova rapidamente a lâmina e inspecione visualmente as bordas de cera para garantir que todos os poços estejam fechados e que as bordas não sejam tão grossas que invadam os pontos. Armazene as lâminas a 4 °C protegidas da umidade e da luz.
nota: O tempo de espera pode ser aumentado ou diminuído para obter bordas mais grossas ou mais finas.
3. Hibridização de um anticorpo PTM de histona com um microarray de peptídeos
- Prepare o tampão de hibridização (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
- Equilibre a lâmina no tampão de hibridização usando um vaso de hibridização. Cubra completamente toda a lâmina em tampão de hibridização e incube por 30 min a 4 °C em um agitador orbital em baixa velocidade.
- Prepare uma solução contendo anticorpo PTM de histona diluída em tampão de hibridização.
nota: Nos dados de exemplo, tanto o anticorpo # 1 da histona quanto o anticorpo # 2 foram diluídos 1:1.000 no tampão de hibridização. Recomenda-se como ponto de partida um intervalo de diluição semelhante ao utilizado para o immunoblotting.
- Incubar a matriz com a solução de anticorpos durante 1 h a 4 °C. Remover a solução de anticorpos e lavar a matriz 3 vezes durante 5 min a 4 °C com PBS frio, pH 7,6.
- Prepare uma diluição de 1:5.000 - 1:10.000 de anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente em tampão de hibridização.
- Incubar a matriz com solução de anticorpos secundários durante 30 minutos a 4 °C protegida da luz. Remova a solução de anticorpo secundário e lave a lâmina de microarray 3 vezes por 5 min a 4 °C com PBS, pH 7,6. Mergulhe o microarray em um tubo cônico de 50 mL contendo 0,1x PBS, pH 7,6 para remover o excesso de sal em temperatura ambiente. Seque a lâmina em uma centrífuga de lâmina de microarray à temperatura ambiente.
- Digitalize a lâmina com um scanner de microarray com resolução de 25 μm ou superior, seguindo o protocolo de digitalização recomendado pelo fabricante do scanner de microarray.
nota: Se o marcador de biotina marcado com fluoresceína estiver presente, escaneie o canal verde (ex: 488 nm, em: 509 nm) e o canal que corresponde ao anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente, normalmente vermelho (ex: 635 nm, em: 677 nm). O objetivo da varredura é obter arquivos de .tif de canal único que podem ser mesclados em um único arquivo .png.
