1. Preparação de embriões de peixe-zebra
- Monte tanques de travessia de peixes à tarde antes das 17h00, com uma fêmea de peixe selvagem e um macho Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisórias para separá-los em cada tanque.
- Remova as divisórias antes das 11:00 da manhã de todos os tanques de cruzamento na manhã seguinte. Fique quieto e não perturbe os peixes enquanto eles estão acasalando. A desova normalmente ocorre dentro de 30 minutos após a remoção dos divisores. Os ovos fertilizados permanecem no fundo do tanque.
- Colete os ovos fertilizados dos tanques com um filtro de malha. Transfira os ovos lavando-os em uma placa de Petri cheia de água de ovo e examine os embriões em um microscópio de dissecação com uma ampliação de 10x a 20x.
- Transfira os embriões fertilizados para uma petridela limpa contendo aproximadamente 20 mL de meio embrionário (100 mL de solução estoque 1.000x contém 29,4 g de cloreto de sódio (NaCl), 1,27 g de cloreto de potássio (KCl), 4,85 g de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2,2H 2O) e 8,13 g de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO 4,7H 2O)) com pipetas Pasteur de vidro de grande calibre. Manter os embriões a 28 °C. Manter 50 embriões fertilizados por placa de Petri com 30 mL de meio embrionário a 28,5 °C.
NOTA: Um par de peixes normalmente produz 100-300 embriões, e a taxa de fertilização e sobrevivência de embriões saudáveis é superior a 95% para cada acasalamento.
- Na manhã seguinte, retire os embriões da incubadora às 8:00 da manhã, quando os embriões atingirem o estágio de desenvolvimento de ~ 18-20 h pós-fertilização (hpf). Observe-os sob um microscópio de epifluorescência com uma ampliação de 20x, usando luz branca no início. Naquela época, os embriões de peixe-zebra estão no estágio de 20 somitos.
- Descarte os embriões mortos que estão turvos ou rompidos ao microscópio usando uma pipeta de vidro.
- Ligue a lâmpada fluorescente e escolha a configuração do filtro de proteína fluorescente vermelha (RFP) do microscópio. Em seguida, selecione os embriões com forte fluorescência vermelha e transfira-os para um novo prato com água de ovo.
- Descorione os embriões manualmente com duas pinças finas (as pontas das pinças devem ser afiadas e não danificadas) sob luz branca (Tabela de Materiais).
- Segure o córion com um par de pinças e rasgue o córion com a outra pinça. Abra a lágrima cuidadosamente usando a pinça e torne-a grande o suficiente para que o embrião passe, empurrando suavemente o embrião com as pontas da outra pinça.
- Transfira os embriões descorionados para uma nova placa de Petri com meio embrionário fresco para um enxágue rápido antes da microinjeção.
2. Preparação da microinjeção
- Use os capilares (1,2 mm de diâmetro externo (OD), 0,9 mm de diâmetro interno (ID), com filamento) para puxar agulhas de injeção finas em um extrator. Projete e otimize o programa de tração de acordo com o manual.
- Abra a ponta da agulha com uma pinça sob um microscópio de estereodissecção. Faça o diâmetro da ponta em torno de 10 μm e o ângulo de conicidade em torno de 30°.
- Conjugar o anticorpo monoclonal anti-Dld de ratinho com o anti-IgG-Atto647N de ratinho antes da injeção.
- Para cada experimento de injeção, misture 0,5 μL do anticorpo anti-Dld (0,5 mg / mL) com 2 μL do anticorpo anti-IgG-Atto647N de camundongo (1 mg / mL) pipetando 5-10 vezes. Em seguida, incube em temperatura ambiente por pelo menos 30 min (ou no gelo por 2-3 horas).
- Após a incubação, adicione 2,5 μL de tampão de bloqueio (10 mg / mL de IgG de camundongo) e 0,5 μL de vermelho de fenol a 0,5% à mistura de anticorpos e pipete 10x para misturar completamente para bloquear quaisquer anticorpos não conjugados remanescentes na mistura.
nota: Para cada ensaio, prepare uma mistura extra sem o anticorpo anti-Dld e use-a como controle.
- Prepare agarose de baixo ponto de fusão a 1% no meio embrionário. Aquecer a mistura contendo agarose a 70 °C até que a mistura fique transparente.
- Alíquota da solução de agarose em tubos de microcentrífuga de 2 ml. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.
- Enxágue o embrião no tubo contendo 1% de agarose de baixo ponto de fusão por 3 s.
- Coloque o embrião em uma tampa de placa de Petri de plástico invertida junto com gotas individuais de agarose (~ 30-40 μL) para montar cada embrião separadamente na tampa, conforme mostrado na Figura 1. Coloque os embriões lateralmente na agarose e mantenha essa posição até que a agarose se solidifique à temperatura ambiente.
- Monte 12 embriões em três fileiras, um por um, como acima. Cubra todos os embriões montados na agarose com meio de ovo.
3. Microinjeção
- Coloque os embriões embutidos sob o estereomicroscópio e cubra a agarose com água de ovo.
- Coloque o injetor de pressão de ar junto com os micromanipuladores, colocando-os próximos aos microscópios, conforme mostrado na Figura 1. Use o cilindro de gás de aço contendo nitrogênio gasoso (N2) sob alta pressão como recurso de ar.
- Abra a válvula de gás somente depois que os embriões tiverem sido montados na agarose. Em seguida, carregue a agulha de vidro preparada com 2 μL de mistura de anticorpos no micromanipulador, conforme mostrado na Figura 1, ao usar o módulo de enchimento frontal do microinjetor.
- Ajuste a pressão de entrada para ~ 80-90 psi e a pressão de injeção para ~ 20 psi.
- Calibre o volume da injeção usando um micrômetro sob o microscópio, conforme descrito anteriormente. Defina a duração do tempo de sintonia para 10 ms a 120 ms, de acordo com o tamanho da abertura da agulha. Administre cada pulso de injeção batendo na pá. Ajuste o volume de injeção de cada entrega para ~4-5 nL.
- Enfie a ponta da agulha de microinjeção através da placa do teto dorsal do rombencéfalo posterior ao ponto de dobradiça r0 / r1 e injete cerca de 10 nL (dois ou três pulsos) de mistura de anticorpos sem atingir o tecido cerebral. Observe o fluxo de fluidos vermelhos no ventrículo cerebral.
nota: O ventrículo do rombencéfalo é posterior ao limite do mesencéfalo. A mistura de anticorpos contendo vermelho de fenol injetada preenche o ventrículo cerebral do rombencéfalo ao prosencéfalo imediatamente, difundindo-se com o líquido cefalorraquidiano.
- Após a injeção, remova a ponta da agulha do embrião rapidamente, girando o botão do micromanipulador. Para uma injeção bem-sucedida, o corante vermelho da mistura injetada permanece no ventrículo cerebral de forma estável, sem vazar para a agarose circundante.
- Mova a placa de montagem sob o microscópio para localizar outro embrião montado em uma posição adequada para repetições.
- Depois de injetar de seis a oito embriões, descasque a agarose com uma faca microcirúrgica para liberar os embriões da agarose incorporada. Transfira os embriões microinjetados para um prato fresco com 30 mL de meio embrionário e coloque-os em temperatura ambiente para as próximas etapas.
4. Montagem e imagens ao vivo com lapso de tempo
- Após 30 min, transfira os embriões selecionados para 10 mL de meio embrionário. Adicione 420 μL de estoque de tricaína (4 mg/mL) a 10 mL de meio embrionário para anestesiar os embriões.
- Para montar os embriões, prepare agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% contendo a mesma concentração de tricaína no tubo. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.
- Use uma pipeta de vidro para mergulhar os embriões injetados na agarose quente por 3 s. Em seguida, remova imediatamente os embriões da agarose com a mesma pipeta de vidro e coloque os embriões no centro de placas de cultura de fundo de vidro de 35 mm com uma gota de agarose do tubo. Coloque apenas um embrião por gota no copo.
- Oriente os embriões suavemente com uma sonda de fibra ou ponta de carregamento para manter o lado dorsal do cérebro embrionário o mais próximo possível do fundo de vidro. Ajuste a posição do embrião suavemente para estender o embrião sem enrolar à medida que a agarose se solidifica gradualmente.
- Depois, verifique a posição do embrião virando o prato com fundo de vidro. Certifique-se de que todo o prosencéfalo dorsal com os embriões montados corretamente possa ser visto ao microscópio.
- Adicione 2-3 mL de meio embrionário pré-aquecido a 28,5 °C contendo tricaína para cobrir o embrião. Coloque o prato corretamente no estágio de temperatura controlada do microscópio confocal, conforme mostrado na Figura 1. Ajuste a temperatura da câmara de imagem para 28.5 °C. O embrião agora está pronto para a imagem.
