Imunolocalização de proteínas e pectinas de arabinogalactana em tecido vegetal

Resumo

Fonte: Costa, M., et al. Imunolocalização fluorescente de proteínas e pectinas de Arabinogalactan na parede celular de tecidos vegetais. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para localizar proteínas arabinogalactâcticas (AGPs) e pectinas em tecidos vegetais. Seções de tecido vegetal fixas e embebidas em resina são coradas com anticorpos primários e secundários fluorescentes específicos para AGP e pectina e um corante fluorescente de ligação à celulose para revelar sua colocalização específica do tecido na parede celular.

Protocolo

1. Imunolocalização

NOTA: O procedimento de imunolocalização fluorescente depende do uso sequencial de dois anticorpos. O anticorpo primário é aumentado contra um antígeno alvo específico. O anticorpo secundário é levantado especificamente contra o anticorpo primário e, para técnicas fluorescentes, é conjugado a um fluoróforo (FITC [isotiocianato de fluoresceína] neste protocolo específico). O anticorpo primário será usado para detectar o antígeno alvo na amostra, e o anticorpo secundário será usado para marcar o local onde o anticorpo primário se conectou à amostra após a lavagem do excesso de anticorpo primário. Os controles são uma parte importante deste ensaio e devem sempre ser realizados para garantir a precisão das observações. Um poço na lâmina deve ser reservado para uso como controle negativo, onde o tratamento primário com anticorpos será ignorado e, portanto, nenhum sinal deve ser observado no final do experimento. Deve ser incluído na experiência um controlo positivo, tratando-se bem a pessoa com um anticorpo cuja marcação já é conhecida e certa. O controlo positivo é utilizado para confirmar a eficácia da marcação de anticorpos secundários e as condições de reacção, enquanto o controlo negativo testa a especificidade dos anticorpos secundários.

1. Prepare uma câmara de incubação colocando algumas toalhas de papel umedecidas no fundo de uma caixa de pontas de pipeta e envolvendo-a com papel alumínio (Figura 1B-1E). Coloque as lâminas na câmara de incubação.
2. Pipete uma gota de 50 μL por poço de 8 mm de solução bloqueadora (5% de leite em pó desnatado (p / v) em solução salina tamponada com fosfato 1 M [PBS]) e incube por 10 min. Remova a solução de bloqueio e lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 min.
3. Preparar as soluções primárias de anticorpos (ver Tabela 1), anticorpo 1:5 (v/v) em solução de bloqueio; fazer uma estimativa de cerca de 40 μL por poço de 8 mm.
   nota: A concentração do anticorpo deve ser ajustada de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Realize uma lavagem final com água bidestilada (ddH₂O) por 5 min, nunca deixe os poços secarem completamente.
5. Pipetar a solução de anticorpos primários para os alvéolos de reacção. Solução de bloqueio de pipetas para os poços de controle.
6. Feche a câmara de incubação e deixe repousar por 2 h em temperatura ambiente, seguido de uma noite a 4 ° C. Prepare a solução de anticorpos secundários, 1% em solução de bloqueio (v / v) cerca de 40 μL por poço. Mantenha-o coberto com papel alumínio.
7. Lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 min, seguido por 10 minutos adicionais com ddH₂O. Certifique-se de que nenhum vestígio da solução de bloqueio ou depósitos seja visível nos poços.
8. Pipetar a solução de anticorpos secundários para todos os alvéolos. A partir de agora, proteja os slides da luz.
9. Incube por 3–4 h no escuro em temperatura ambiente.
10. Lave todos os poços duas vezes por 10 min com PBS, seguido de outra lavagem de 10 min com ddH₂O.
11. Aplique uma gota de calcofluor (1:10.000 (p / v) fluorescente mais brilhante 28 em PBS) em cada poço. Sem lavar, aplique uma gota de meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) em cada poço e coloque uma lamínula (Figura 2H).
12. Observe com um microscópio de fluorescência, equipado com lentes 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 e 100x/1,40, use filtros UV (para coloração de calcofluor) e FITC, para detectar parede celular e imunolocalização, respectivamente (Figura 2I). Use os seguintes comprimentos de onda: excitação/emissão (nm) 358/461 para UV e 485/530 para FITC.
13. Para uma melhor visualização dos resultados, sobreponha ambas as imagens com ImageJ ou similar.

Tabela 1: Lista de anticorpos monoclonais úteis. A tabela acima representa um exemplo de anticorpos disponíveis, com informações sobre seus alvos e onde eles podem ser adquiridos.

nome	afinidade	Disponível em
LM2	Proteína de Arabinogalactan	Sondas de plantas (Leeds, Reino Unido)
LM5	Pectinas
LM6	Arabinan
LM7	Homogalacturonano
LM8	xilogalacturonano
LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
LM14	Proteína de Arabinogalactan
LM16	Arabinan processado - RG-I
LM18	Homogalacturonano
LM19	Homogalacturonano
LM20	Homogalacturonano
LM26	GALACTANO-RAMIFICADO
LM30	Proteína de Arabinogalactan
JIM5	Homogalacturonano com baixo teor de metil-esterificado	CCRC (Geórgia, EUA)
JIM7	Homogalacturonano altamente metil-esterificado
JIM4	Proteína de Arabinogalactan
JIM8	Proteína de Arabinogalactan
JIM13	Proteína de Arabinogalactan
JIM15	Proteína de Arabinogalactan
JIM16	Proteína de Arabinogalactan
JIM20	Extensina
MAC207	Proteína de Arabinogalactan

Resultados

Figura 1. (A) Representação esquemática da sequência de corte do bloco para preparar a amostra (bloco amarelo) para seccionamento com o ultramicrótomo. Em primeiro lugar, a cápsula de gelatina é removida (1). Em seguida, são primeiro cortados num ângulo de 40° a 45° em relação aos lados da cápsula tangencialmente à amostra (2), efectua-se um segundo corte a 90° do primeiro (3), seguido de um terceiro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
8 poços Lâminas de reação de vidro	Marinfeld	MARI1216750	Outras marcas podem ser usadas
Produção de anticorpos anti-IgG (molécula de lobo) anti-FITC em GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
lamínulas, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	A lamínula deve cobrir todos os poços. Outras marcas podem ser usadas
ddH2O	na	na
Etanol absoluto	na	na
Branqueador fluorescente 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Leite em pó desnatado	Nestlé	na	qualquer leite em pó desnatado é adequado
forno	na	na	forno de laboratório genérico
Anticorpo monoclonal gerado por rato	Sondas de plantas	na	Vários anticorpos que reconhecem os componentes da parede celular estão disponíveis no centro de pesquisa de carboidratos complexos (CCRC, Universidade da Geórgia, EUA) e nas sondas de plantas (Paul Knox Cell Wall Lab, na Universidade de Leeds, Reino Unido). Uma pequena lista de alguns MABS comumente usados e onde eles podem ser adquiridos é apresentada na Tabela Suplementar 1
microscópio de epifluorescência vertical com filtros de fluorescência UV e FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
câmara de vácuo	na	na
bomba de vácuo	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Outros anti-fade podem ser usados. Verifique a compatibilidade com o FITC e o branqueador Fluorescente 28. (Nota: para uma alternativa não comercial, (ver Jonhson et al 198218) Um meio antidesbotamento pode ser feito misturando 25 mg / mL de 1,4-Diazobiciclo- (2,2,2) octano (DABCO) em glicerol 9: 1 (v / v) a 1xPBS. Ajuste o pH para 8,6 com HCl diluído.)