Usando um sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em uma vacina

Resumo

Fonte: Jallet, C. et al., Teste ELISA in vitro para avaliar a potência da vacina antirrábica.J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo mostra um ensaio de imunoabsorção enzimática indireta ou ensaio de imunocaptura em sanduíche ELISA projetado para avaliar os níveis de glicoproteína imunogênica em vacinas. A placa de ensaio, contendo anticorpos específicos para glicoproteínas, é incubada com amostras de vacinas diluídas em série, incluindo vacinas de referência e de teste, seguidas de imunoensaio para quantificar o conteúdo de glicoproteínas na vacina de teste.

Protocolo

1. Precauções de segurança

NOTA: Este método é aplicável tanto ao vírus vivo da raiva (RABV) quanto à vacina inativada.

1. Use boas práticas de laboratório e procedimentos de segurança.
2. Use Equipamento de Proteção Individual (EPI) adequado, incluindo casaco descartável, luvas, máscaras, óculos, etc.
3. Quando o vírus vivo for titulado, use uma cabine de segurança biológica classe II.
   1. Considerar qualquer material em contacto com as amostras (reagentes, soluções de lavagem, etc.) como material infeccioso.
   2. Trate o material contaminado imergindo-o na solução de lixívia (hipoclorito de sódio a 2,5%) durante 30 min para descontaminação.
4. Manusear produtos químicos de acordo com as boas práticas de laboratório.

2. Preparação

1. Use reagentes de grau analítico sempre que possível.
2. Preparar soluções frescas do tampão de revestimento/tampão de carbonato, tampão de passivação, diluente e tampão citrato (quadro 1), filtrar através de filtros de 0,45 ou 0,22 μm e conservar a 4 °C durante um dia antes da utilização, a fim de preservar a sua pureza analítica.
3. Deixe os reagentes atingirem a temperatura ambiente (+18 °C a +25 °C) 30 minutos antes do uso e homogeneizar por mistura suave antes do uso.

3. Sensibilização de microplacas

NOTA: Use 96 placas de imunoensaio de adsorção de poço que são otimizadas para ligar grandes quantidades de imunoglobulinas (por exemplo, consulte a Tabela de Materiais).

1. Em cada poço, adicionar 200 μL do anticorpo monoclonal (mAb-D1) diluído no tampão carbonato.
   nota: Uma concentração ideal de cerca de 1 μg / mL foi determinada experimentalmente e corresponde a uma diluição aproximada de 1/2000 do mAb-D1 purificado. Esta concentração recomendada é indicada para cada lote de mAb-D1 e deve ser verificada periodicamente com o controlo positivo.
2. Cobrir a placa com uma película adesiva e incubar a microplaca durante 3 h a 37 °C numa atmosfera humidificada.
3. Aspirar e transferir cuidadosamente o conteúdo do alvéolo para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
4. Inverta a microplaca e deixe secar sobre um papel absorvente à temperatura ambiente durante 5 min.

4. Passivação de microplacas

1. Para cada poço, adicione 300 μL do tampão de passivação.
2. Cobrir a placa com uma película adesiva e incubar durante 30 min a 37 °C.
3. Aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo do alvéolo para um recipiente contendo solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
4. Inverter a microplaca e deixar secar sobre papel absorvente à temperatura ambiente durante 1 min.
   nota: A microplaca pode ser usada imediatamente ou armazenada selada a -20 °C por até 3 meses até o uso.

5. Ensaio ELISA

NOTA: Para estabelecer a curva de controle da vacina de referência, não é necessária a Etapa 5.3; para titular a vacina testada, todas as Etapas 5.1 a 5.6 são necessárias.

1. Lavagem da microplaca sensibilizada
   1. A cada poço, adicione 300 μL do tampão de lavagem.
   2. Aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo do alvéolo para um recipiente contendo solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
   3. Repita as etapas 5.1.1 e 5.1.2 mais cinco vezes para lavar extensivamente a placa sensibilizada.
   4. Inverta a microplaca e deixe secar sobre um papel adsorvente à temperatura ambiente durante 1 min.
2. Diluições da vacina de referência para a curva de controlo
   1. Reconstituir a vacina de referência (antigénio de validação Lote 09) em 1 ml de água destilada correspondente a uma concentração de 10 μg/ml de glicoproteína do vírus da raiva.
   2. Preparar uma diluição de dez vezes da vacina de referência reconstituída no diluente para atingir 1 μg/ml de glicoproteína do vírus da raiva.
   3. Preparar 6 diluições duplas em série desta vacina de referência no diluente, conforme indicado no quadro 1.
   4. Distribua 200 μL do diluente em duplicata (poços 1H/2H) para servir como um controle em branco.
   5. Distribuir 200 μL por alvéolo de cada diluição da vacina de referência em duplicado (alvéolos G1/G2 a A1/A2).
3. Diluições da vacina testada para sua titulação
   1. Preparar uma diluição de dez vezes da vacina testada no diluente.
   2. Preparar 7 diluições duplas em série da vacina testada em diluente, conforme indicado no Quadro 2.
   3. Distribuir 200 μL por alvéolo de cada diluição da vacina testada em duplicado (alvéolos H3/H4 a A3/A4).
4. Incubação/Lavagem da placa ELISA
   1. Cobrir a microplaca com uma película adesiva e incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Retirar a película, aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo de cada alvéolo para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
   3. A cada poço, adicione 300 μL de tampão de lavagem.
   4. Aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo de cada alvéolo para um recipiente contendo solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
   5. Repita as etapas 5.4.3 e 5.4.4 cinco vezes para remover o antígeno não ligado e conservar os trímeros de proteína G ligados ao anticorpo revestido (mAb D1).
   6. Inverta a microplaca e deixe secar sobre papel absorvente à temperatura ambiente durante 1 min.
5. Ligação da peroxidase conjugada mAb-D1
   1. Distribuir 200 μL por alvéolo da diluição recomendada (1/2000) de mAb-D1 marcado com peroxidase no diluente (concentração aproximada de 1 μg/ml). Indica-se uma concentração recomendada para cada lote de mAb-D1 e deve ser verificada periodicamente com o controlo positivo.
   2. Cobrir a microplaca com uma película adesiva e incubar durante 1 h a 37 °C.
   3. Retirar a película, aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo de cada alvéolo para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
   4. Adicione a cada poço, 300 μL do tampão de lavagem.
   5. Aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo de cada alvéolo para um recipiente contendo solução de hipoclorito de sódio a 2,5%.
   6. Repita as etapas 5.5.4 e 5.5.5 cinco vezes para remover o anticorpo marcado com peroxidase não ligado (mAb D1).
   7. Inverta a microplaca e deixe secar sobre papel absorvente à temperatura ambiente durante 1 min.
6. Revelação usando um substrato-cromogênio
   1. Distribuir 200 μL por alvéolo de solução substrato-cromogénio.
   2. Sele a microplaca com um filme e incube no escuro em temperatura ambiente por 30 min. Uma cor amarelo-laranja se desenvolve cuja intensidade é proporcional à quantidade de anticorpos marcados com peroxidase ligada (mAb D1).
   3. Pare a reação adicionando 50 μL de solução de parada por poço.
   4. Limpe cuidadosamente o fundo da microplaca e coloque-a em um espectrofotômetro para determinar a densidade óptica (OD) a 492 nm de todos os poços usados: controle negativo (branco), vacina de referência e vacina testada.
   5. Colete dados OD em formato de arquivo .xls ou .xlsx para análise.

Tabela 1. Tampões usados no ensaio.

Tampões e reagentes	preparação
Tampão de revestimento (Tampão carbonato 50mM pH = 9,6)	Adicione carbonato de sódio 50 mM (Na2CO 3-10H2O) ao bicarbonato de sódio 50 mM (NaHCO3) até o pH desejado (cerca de 1/10 volume de bicarbonato de sódio)
Buffer de passivação	0,3% de albumina de soro bovino (BSA, fração V), 5% de sacarose em tampão carbonato 50 mM pH 9,6
10x Fosfato tamponado com solução salina pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H 2O 11,33 g, KH2PO4 2g em 1L de água destilada. Ajuste o pH = 7 com 4N NaOH
Tampão de lavagem	0,05% de interpolação em 1x PBS
Diluente	0,5% de albumina de soro bovino (fração V), 0,05% de interpolação em 1x PBS (ajuste o pH para 7 devido à acidificação por BSA)
Tampão citrato pH-5.6 (para substrato de peroxidase)	11,67 g de citrato trissódico-2H2O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 g de ácido cítrico-1H20 em 1L de água destilada
Solução substrato-cromógeno	50 mg de comprimido de ortofenilenodiamina, 0,1% de peróxido de hidrogênio 30% (110 vol) em 25 ml de tampão citrato pH 5,6
Solução de parada (ácido sulfúrico 4N)	10 ml de H2SO4 36N em 80 ml de água destilada resfriada. A diluição deve ser efectuada em banho de gelo

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gabinete de Segurança Biológica Classe II	ThermoFisher Scientific	10445753	Se titular o vírus vivo
Placas Transparentes de Fundo Plano Imuno Não Estéril de 96 Poços, 400 μL, MAXISORP	ThermoFisher Scientific	439454	Bom para ligação ao anticorpo carregado
Equipar a Hotte de Laboratório de Polipropileno Labo	ThermoFisher Scientific	12576606	Para a preparação de ácido sulfúrico
Placa de Imunologia Strong Adsorção MAXISORP Fundo Plano Poço F96	Dutscher	Rolamento 55303	Bom para ligação ao anticorpo carregado
Fita de vedação de microplacas (100 folhas)	ThermoFisher Scientific	Rolamento 15036
Leitor monomodo de microplacas Sunrise	TECAN
Agitador-incubadora de microplacas	Dutscher	441504
Lavadora de microplacas Wellwash	ThermoFisher Scientific	Rolamento 5165000
Pipeta multicanal (30-300 μL) 12 canais	ThermoFisher Scientific	Rolamento 4661180N
Pipetas de canal único (Kit 2: Finnpipetas F2 0,2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)	ThermoFisher Scientific	4700880