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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Informações básicas do grupo de estudo
NOTA: O Repositório de Informações sobre Alergia do Laboratório Estadual de Doenças Respiratórias (AIR-SKLRD) é um grande banco de soro estabelecido dentro do Instituto de Hospital Respiratório de Guangzhou (GIRH). Iniciado na última década, o AIR-SKLRD já iniciou a coleta e armazenamento de amostras de soro de pacientes com doenças alérgicas e suas informações clínicas (Tabela 1). O presente estudo foi realizado com soros do AIR-SKLRD.
- Pesquise no banco de dados do AIR-SKLRD soros coletados de janeiro de 2015 a junho de 2018 e selecione os pacientes com doenças alérgicas que foram considerados sensíveis aos alérgenos comuns na região.
- Certifique-se de que todos os pacientes selecionados tenham doenças relacionadas a alergias, como rinite alérgica e/ou asma, dermatite alérgica e/ou urticária, e que o soro desses pacientes contenha múltiplas sensibilizações de imunoglobulina E (sIgE) específicas para alérgenos séricos de alérgenos comuns nesta região, detectada pelo Sistema 1.
- Excluir pacientes com registros médicos incompletos, aqueles perdidos no acompanhamento, aqueles que se recusam a dar consentimento informado sobre o uso de suas amostras de soro para fins científicos, aqueles com imunodeficiência identificada, aqueles atualmente em imunoterapia ou agentes imunomoduladores ou aqueles com infecções parasitárias.
- Certifique-se de que nenhum tratamento ou prescrição de medicamento foi administrado antes da coleta de soro para minimizar a interferência nos achados laboratoriais. Todas as amostras de soro que não preencheram os critérios foram rejeitadas.
2. Fluxo de estudo e medições de interesse
NOTA: O sistema microfluídico precisa de 100 μL de soro para determinar 19 alérgenos. Sangue venoso (5 mL) foi coletado de cada paciente usando um vaso sanguíneo a vácuo contendo gel separador. Após centrifugação por 10 min a 1.000 x g, a camada superior foi coletada para teste. O soro não utilizado foi armazenado a -80 °C. Antes do teste, o soro foi mantido em temperatura ambiente por 30 minutos e agitado com um misturador de vórtice. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento foram evitados.
- Teste principalmente as amostras de soro para sIgEs para alérgenos inteiros de Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), pêlos de gato (e1), pêlos de cachorro (e5), grama bermuda (g2), capim timóteo (g6), baratas (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans(m5), ambrósia (w1), clara de ovo (f1), leite (f2), trigo (f4), amendoim (f13), soja (f14), amêndoa (f20), caranguejo (f23) e camarão (f24). Siga as instruções fornecidas na seção 3.
NOTA: A determinação de sIgE foi feita com o kit de ensaio de IgE específica para alérgenos (consulte a Tabela de Materiais) e medida por um analisador de quimioluminescência.
- Selecionar aleatoriamente três amostras de entre as amostras com soro suficiente (pelo menos 900 μl) para um estudo de reprodutibilidade. Mantendo todas as condições inalteradas, medir os três soros para sIgEs de alérgenos diariamente durante 9 dias consecutivos (ou seja, 100 x 9 = 900 μL de soro).
3. Procedimento de teste de semi-automação do sistema microfluídico
NOTA: O Sistema 2 integra tecnologia microfluídica automática, microarray de proteínas, análise de luz fria, análise paralela de IgE e tecnologia de processamento de imagem. O protocolo de teste é dividido em quatro partes: preparação do equipamento, carregamento da amostra, incubação e medição.
- Preparação do equipamento
- Ligue o PC e o analisador power.
nota: O botão liga/desliga está à esquerda da base.
- Inicie o programa LabIT no PC. Se a janela de aviso do Dark Frame aparecer, clique em OK para executar o teste de vazamento. Em seguida, clique no logotipo central para entrar na interface de operação.
nota: O sistema lembrará o usuário de executar o teste de vazamento se estiver ocioso por mais de 24 horas.
- Verifique a temperatura de reação e a temperatura do CCD (dispositivo de carga acoplada) no canto inferior direito da tela. A temperatura de reação deve subir para 37 °C ± 1 °C em cerca de 10 minutos, e a temperatura do CCD deve cair para -15 °C ± 1 °C.
- Execute o teste de VAZAMENTO depois que a temperatura do CCD cair para -15 °C ± 1 °C. Antes de executar o teste LEAK, certifique-se de que nenhum outro item seja deixado dentro do instrumento e feche a porta. Clique em Ferramentas | Teste do Sistema | Teste de VAZAMENTO. Não abra a porta durante o teste. Quando o teste for concluído, a janela do relatório será exibida.
- Carregamento de amostras
- Adicione 620 μL de tampão de lavagem, 120 μL de tampão de bloqueio, 60 μL de conjugados A e B, 60 μL de substrato A e B e 100 μL de amostras de soro ao tanque de reagente correspondente no cartucho microfluídico.
- Incubação
- Clique em ID do cartucho, use o leitor de código de barras para escanear o número de série do cartucho, insira o ID da amostra, coloque o cartucho no analisador, feche a porta e clique em Analisador e Executar para iniciar a análise.
- medição
- Exporte os resultados para um software estatístico (por exemplo, Excel) após a medição.
NOTA: Após 30 min de incubação, o analisador realiza automaticamente a medição e relata o resultado.
Tabela 1: Características demográficas dos pacientes. No total, foram encontrados 293 indivíduos que preencheram os critérios de inclusão, com mediana de idade de 23 anos (intervalo interquartil de 8 a 36 anos). Destes, 170 (58,02%) eram do sexo masculino e 123 (41,98%) do sexo feminino. Além disso, 92 (31,40%) deles tinham rinite alérgica, 117 (39,93%) tinham asma alérgica, 36 (12,29%) tinham comorbidade de rinite e asma e 48 (16,38%) tinham outras doenças alérgicas, como alergia alimentar ou alergia de pele.
| característica | Não.( %) |
| Sexo, n(%) | |
| fêmea | 123 (41,98%) |
| macho | 170 (58,02%) |
| Idade, ano, n(%) | |
| Mediana (25%,75%) | 23(8,36) |
| ≤10 | 97 (33,11%) |
| 11-20 | 37 (12,63%) |
| 21-40 | 101 (34,47%) |
| >41 | 58 (19,80%) |
| Diagnóstico, n(%) | |
| Rinite alérgica | 92(31,40%) |
| Asma alérgica | 117 (39,93%) |
| Rinite alérgica com asma | 36 (12,29%) |
| Outros | 48(16,38%) |